草魚♀×鳡♂雜交F1代同工酶和蛋白質(zhì)的電泳分析

摘要[目的]了解草魚♀×鳡♂雜交F1代的生化遺傳特性。[方法]應(yīng)用聚丙烯酸胺凝膠垂直板電泳技術(shù)，對草鳡雜交F1代的9種組織（心、腦、眼、肝、腎、脾、鰭、肌肉、血漿）的3種同工酶（LDH 、EST、MDH）進(jìn)行了分析，同時比較了其同工酶及蛋白質(zhì)與親本草魚、鳡的差異。[結(jié)果]草鳡雜交F1代的3種同工酶具有不同程度的組織特異性，其同工酶和蛋白質(zhì)與親本之間存在明顯差異。[結(jié)論]這些差異可作為鑒別草鳡雜交魚及親本的標(biāo)志。

關(guān)鍵詞 草魚；鳡；雜交F1；同工酶；蛋白質(zhì)

中圖分類號S965.112文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10573-03

基金項目武漢市科技計劃項目（2013021001010464）。

作者簡介余來寧（1948- ），男，湖北武漢人，教授，博士生導(dǎo)師，從事魚類遺傳育種研究。

雜交育種是農(nóng)業(yè)上常用的培育新品種的主要方法之一。草魚（Ctenopharyngodon idellus）和鳡（Elopichthys bambusa）同屬鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科，分屬草魚屬和鳡屬。二者許多性狀存在優(yōu)勢互補。近年來，筆者進(jìn)行了草魚♀×鳡♂屬間雜交試驗，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)草魚♀×鳡♂雜交F1代（簡稱草鳡雜交F1代）外形上與草魚相似，在生長上和抗病性等方面表現(xiàn)出一定的雜交優(yōu)勢[1]。為了進(jìn)一步開展草鳡雜交后代的選育，摸清草鳡雜交F1代的遺傳性狀十分必要。

同工酶電泳分析方法是從遺傳學(xué)角度研究雜交后代的生化表型變異及組織特異性的重要手段。筆者應(yīng)用聚丙烯酸胺垂直板電泳技術(shù)對草鳡雜交F1代的同工酶和蛋白質(zhì)進(jìn)行了電泳分析，并與親本草魚、鳡進(jìn)行了比較，旨在了解草鳡雜交F1代的生化遺傳特性，同時為尋找鑒別草鳡雜交F1代的生化遺傳標(biāo)志，并為草鳡雜交育種積累資料。

1材料與方法

1.1材料來源試驗所用草魚、鳡及草鳡雜交F1代魚均為1+齡魚，來源于武漢江夏區(qū)魯湖漁場和江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院魚池。每種魚取7～10尾， （草魚體長161～185 mm；鳡體長336～375 mm；草鳡雜交F1代魚體長202～237 mm）。

1.2樣品制備每尾魚先用濃度100 mg/L的MS-222麻醉，使用一次性注射器從魚尾靜脈抽血0.2 ml，放入預(yù)先盛有2 ml含0.1%肝素的生理鹽水的離心管中，用KDC-40型離心機（國產(chǎn)），以1 500 r/min離心8 min，取上清液血漿置于4 ℃冰箱備用，并收集離心管下部的紅血球，用生理鹽水洗滌2次。加入紅血球體積2倍的無離子水，低滲振蕩破碎紅血球。然后，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min，取紅色透明的上清液（含血紅蛋白Hb）置于4 ℃冰箱備用。

將采血后的魚立即解剖，取心、腦、眼、肝、腎、脾、肌、鰭等組織，稱取0.2 g，加入10倍的磷酸緩沖液（0.01 mol/L，pH7.4），使用玻璃勻漿器在冰浴中勻漿。然后，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min。取上清液置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3電泳和染色采用聚丙烯酰胺垂直板連續(xù)系統(tǒng)電泳（pH8.9，僅有分離膠，無濃縮膠），使用JYSCZ2型電泳槽，分析同工酶的凝膠濃度為8%，分析蛋白質(zhì)的凝膠濃度為10%。電泳和染色方法參照《遺傳學(xué)實驗方法和技術(shù)》[2]及有關(guān)文獻(xiàn)[3-5]，并稍有改進(jìn)：將電泳槽放在冰浴中進(jìn)行電泳。

1.4酶譜帶型表示方法將同一種酶電泳圖譜上的所有條帶按照遷移率快慢依次編號，泳道樣品的帶型，以其擁有的條帶號組成，并按染色深淺（活性大小）由左至右排序。將此方法稱為帶型碼。例如，LDH共有7條帶，按遷移率快慢依次編號為1、2、3、4、5、6、7。其中，肝臟（L）有5條帶，其帶號為12456（缺3號帶），再將帶號按染色深淺排序，肝臟（L泳道）第5條帶染色最深，就排在左側(cè)第1位；染色次深的是第6條帶，就排在左第2位。因此肝臟帶型應(yīng)為56124。眼（E）和腦（B）均有5條帶，帶號均為12345，看不出區(qū)別，但按染色深淺排序后則分別為15234和23451，就可以反映出2個樣品的譜帶及活性差異。若要精確確定條帶染色深淺（活性大小），可用BandScan或Quantity One 等軟件分析確定次序。另外，還可以在帶型碼前面加上代表組織的字母，如腦（代號是B）其帶型碼可寫為B23451。此方法同樣適用于蛋白質(zhì)的電泳分析。

2結(jié)果與分析

2.1草鳡雜交F1代不同組織的同工酶分析

2.1.1乳酸脫氫酶（LDH 1. 1. 1. 27）。乳酸脫氫酶為四聚體酶，一般由LDHA，LDHB 2基因位點控制。在許多種魚類中還存在LDHC基因。草鳡雜交F1代的LDH同工酶共有7條酶帶（圖1）， 由LDHA 和LDHB 亞基組合而成的5條酶帶從正極到負(fù)極分別為B4、A1B3、A2B2，A3B1 A4，在9種組織中都有表達(dá)；箭頭所指的第6條酶帶（C4）是由LDHC基因編碼，僅在肝臟酶譜中表達(dá)。在血漿中靠近負(fù)極有一條很細(xì)的酶帶，其遺傳背景還不清楚，暫定為LDHX。草鳡雜交F1代LDH同工酶活性具有組織特異性，LDH同工酶在肌肉中活性強，LDHB4在脾臟中優(yōu)勢表達(dá)而在肝臟中表達(dá)較弱，LDHA4在肝臟、肌肉、血漿中優(yōu)勢表達(dá)，但肝臟中缺乏同工酶A2B2。這種組織特異性與相應(yīng)的生理功能有關(guān)。用帶型碼表示9種組織的LDH酶譜帶型即分別為S51234、K15234、L56124、M51423、E15234、B23451、H52134、P56312、F35412。通過帶型碼可以看出，9種組織LDH同工酶條帶完全不同，說明草鳡雜交F1代LDH具有明顯的組織特異性。

2.1.2酯酶（EST 3 .1. 1. 1）。魚類酯酶一般為單體或二聚體，由多個基因座位控制。在草鳡雜交F1代的9種組織中有7種表達(dá)EST同工酶，在肌肉和眼中沒有發(fā)現(xiàn)酶帶。電泳圖譜共觀察到3條酶帶（圖2）。為了便于與鳡進(jìn)行比較，按遷移率快慢依次編為EST2、EST3、EST4（鳡有EST1帶）。酯酶在草鳡雜交F1代的肝臟，腎臟、血漿中活性很高，但在血漿中僅有EST2這一條酶帶。EST2、EST 3和EST4在鰭條、肝臟和腎臟中均有表達(dá)，而在脾臟、心臟和腦中EST2不表達(dá)，具有明顯的組織特異性。

2.1.3蘋果酸脫氫酶（MDH 1.1. 1. 37）。蘋果酸脫氫酶具有上清液型（s-MDH）和線粒體型（m-MDH）2種類型，分別由2個基因位點控制，為二聚體。草鳡雜交F1代不同組織中的MDH共有9條帶（圖3），s-MDH有3條帶，僅在肌肉、眼晶體、鰭和血漿中表達(dá)；m-MDH有6條帶，在除血漿外的其他8種組織中表達(dá)。草鳡雜交F1代MDH組織特異性非常明顯，9種組織呈9種帶型，完全不同。

2.2草鳡雜交F1代與親本草魚、鳡的同工酶比較

2.2.1LDH比較。以草鳡雜交F1代的鰭條、血漿與親本進(jìn)行LDH同工酶分析比較。從圖4可以看出，草鳡雜交F1代與親本草魚、鳡之間存在明顯差異，在血漿中都有LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5 5條酶帶，而F1代還多1條LDH6，是雙親所沒有的酶帶（見圖中箭頭所指），顯然這是由雜交產(chǎn)生的新帶。在肝臟中F1代有5條帶，而草魚只有2條帶，鳡有6條帶，存在明顯差異。

2.2.2EST比較。從圖5可以看出草鳡雜交F1代與親本鰭條的EST電泳圖譜差異顯著，F(xiàn)1代EST電泳圖譜有3條帶，其中EST2、EST3條帶與草魚相同，但比草魚多1條帶EST4，這條帶與鳡相同，顯然是雜交中由鳡提供的基因。草魚與鳡二者之間差異很大，沒有共同的酶帶，前者有EST2、EST3條帶，而后者有EST1、EST4條帶。

2.3草鳡雜交F1代與親本草魚、鳡蛋白質(zhì)的電泳比較

2.3.1血紅蛋白（Hb）電泳比較。從圖7可以看出，F(xiàn)1代Hb有4條帶，其中有3條帶（Hb1、Hb2、Hb3）與草魚相同，但多1條雜交帶Hb4，是雙親所沒有的條帶，而鳡只有Hb3條帶，三者之間差異非常明顯。

2.3.2蛋白質(zhì)電泳比較。從圖8可以看出，F(xiàn)1代與親本三者之間存在諸多差異。F1代血漿蛋白質(zhì)有4條帶，草魚有7條帶，鳡有6條帶。血漿中，F(xiàn)1代在47.9 kD處有1條雜交蛋白帶；肌肉中，F(xiàn)1代在78.5和24.8 kD處各有1條雜交蛋白帶。鰭條中，F(xiàn)1代在44.1 kD處有1條雜交蛋白帶（圖中箭頭處）。F1代與親本的3種蛋白質(zhì)的帶型都不同，差異明顯。

3討論

從草鳡雜交F1代9種組織的3種同工酶電泳分析結(jié)果來看，草鳡雜草F1代各組織的同工酶表達(dá)存在明顯的組織特異性。F1代肝臟LDH與其他組織差異很大，多1條C4帶，但草魚肝臟無C4帶，而鳡有C4帶，說明LDHC基因表達(dá)與種類有關(guān)，草鳡雜交F1代的LDHC基因是由鳡提供的。F1代的MDH同工酶9種組織的酶譜都不同，說明MDH是十分活躍的同工酶，根據(jù)各組織的不同功能需求而表達(dá)。F1代的EST同工酶，雖然帶型比較簡單，但組織特異性仍十分明顯，主要表現(xiàn)在表達(dá)與否及活性強度上，EST在F1代的肝臟、腎臟和血漿中活性很高，但在腦組織中極弱，甚至在眼和肌肉不表達(dá)。組織中的同工酶差異與器官的不同生理功能有關(guān)，同時也是基因調(diào)控的結(jié)果，基因調(diào)控使必需基因開放，使不必要的基因關(guān)閉[6-7]，在同工酶電泳凝膠酶帶上表現(xiàn)出有或無。因此，同工酶分析是直觀了解基因表達(dá)和調(diào)控情況的重要手段。

通過同工酶和蛋白質(zhì)電泳的比較分析，筆者已發(fā)現(xiàn)了F1代與草魚、鳡之間的差異可作為鑒別這3種魚的生化標(biāo)志。從電泳圖譜可以看出這些差異，但用文字描述卻很難說清楚。為了簡明扼要說明這些差異，現(xiàn)用帶型碼描述圖譜帶型，比較其差異，歸納于表1。