甘薯莖尖脫毒及組培快繁技術

摘要

[目的]研究甘薯莖尖分生組織的分化培養基配方及快繁培養的影響因素。[方法]以甘薯莖尖作為外植體，總結出莖尖分化培養前的滅菌方法，篩選出適宜的分化培養基配方、快繁培養基配方以及影響快繁的各因素。[結果]75%的乙醇30 s+0.1%升汞10 min能取得較好的滅菌效果，降低污染率;適宜的莖尖分化培養基配方為：MS+0.5 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+0.25 mg/L GA3+10 mg/L病毒唑;快繁培養基配方為：Ms+0.1～0.2 mg/L NAA+2 mg/L泛酸鈣;適宜的糖用量為30 g/L;培養條件為溫度28 ℃、光照強度2 000 lx、光照時間16 h/d時脫毒苗莖段生根較快，側芽萌發后節間適中，有利于提高繁殖系數。[結論]為脫毒苗工廠化生產提供技術支持。

關鍵詞 甘薯; 莖尖培養; 快繁

中圖分類號 S632 "文獻標識碼 A "文章編號 0517-6611（2014）32-11238-02

Sweet Potato Stem Tip Detoxification and Tissue Culture Rapid Propagation Technology

QIN Mei， ZHANG Yan， XU Meien et al

（Chuxiong Prefecture Institute of Agricultural Sciences Research Promotion， Chuxiong， Yunnan 675000）

Abstract [Objective] To study the sweet potato stem tip meristem differentiation medium formula and the influence factors of rapid propagation cultivation. [Method] With sweet potato stem tip as explant， the sterile system establishment， differentiation of stem tip cultured sterilization method， medium filtering， rapid propagation medium formula and its influence factors. [Result] The results showed that 75% alcohol 30 s + 0.1% mercuric chloride 10 min can obtain good sterilization effect， reduce the pollution rate; Appropriate stem tip differentiation medium formula is MS+0.5 mg/L 6BA+0.2 mg/l NAA+0.25 mg/L GA3+10 mg/L ribavirin; Rapid propagation medium formula is： Ms + 0.1 ～ 0.2 mg/L NAA + 2 mg/L calcium pantothenate; The suitable dosage of sugar 30 g/L; Culture conditions for temperature 28 ℃， light 2 000 lx， 16 h/d） virusfree stem section begins to take root quickly， lateral bud germination after internode moderate， propagation coefficient is enhanced. [Conclusion] The study can provide technical support for factory production of virusfree seedlings.

Key words "Sweet potato; Stem tip culture; Rapid propagation

甘薯（Ipomoea batatas）又名山芋、紅芋、番薯、紅薯、地瓜，為旋花科甘薯屬一年生或多年生蔓性草本植物，富含蛋白質、淀粉、果膠、纖維素及多種礦物質，有“長壽食品”之譽，是重要的糧食、飼料和工業原料用作物，在世界糧食生產中總產排列第7位。目前我國甘薯種植面積為600多萬hm2，年產鮮薯1億多t，均居世界首位[1]。甘薯耐旱、耐瘠薄，生物產量高，除食用外，還是重要的可再生能源原料之一，在保障國家糧食安全和能源安全方面的作用日益突顯。但近幾年來，我國甘薯的種植面積增長較緩慢，制約甘薯生產面積增長的主要問題是種性退化，而引起甘薯種性退化的原因主要是病毒侵染[2]。甘薯是無性繁殖作物，主要通過蔓秧、種薯和苗繁殖，病毒易在體內積累，從而逐年加重，造成減產，我國每年因病毒病減產造成損失達40多億。當前防治甘薯病毒病一般采用剝離莖尖分生組織，離體培養后得到脫毒苗來去除病毒，培育、繁殖和應用脫毒種薯[3]。脫去病毒后的甘薯苗恢復了種性，生長勢增強，產量提高，品質變優，增產效果極為明顯，增產幅度可達80%以上，在生產上具有較好的應用前景[4]。

筆者選取云南省楚雄州農業科學研究推廣所推廣的淀粉型甘薯品種——徐薯22作為供試品種，針對甘薯莖尖分生組織培養和擴繁中培養基配方、糖用量等進行了研究，以期提高莖尖培養成活率和成苗率，為脫毒苗工廠化生產提供技術支持。

1 "材料與方法

1.1 "試驗材料

于每年2月初挑選表皮光滑、正常薯形、大小均勻、無病蟲害和無損傷薯塊，放置在25～30 ℃的溫室內進行催芽，7 d后塊莖上的芽開始萌發。

1.2 取材與消毒

當塊莖上的芽叢長至10 cm時，切下頂部約3 cm長的芽段，剪去已展開的葉片，放入燒杯中，倒入0.1%洗衣粉水進行洗滌，流水沖洗20 min，再用紗布吸干水分，置于超凈工作臺上。在無菌操作臺內采用3種不同配比的消毒液進行消毒，倒去消毒液后，用無菌水漂洗5～6次，漂洗后將芽段放在滅過菌的濾紙上吸干水分。不同配比消毒劑處理時間見表1。

1.3 莖尖培養

在超凈工作臺上剪取約1 cm長的幼莖先端，在40倍解剖鏡下切除較大的葉原基，找到位于頂端的莖尖生長點（生長點呈透明扁平的突起），用解剖針切下生長點，長度為0.2～0.3 mm（一般帶1～2個葉原基），切下后，用解剖針將莖尖挑到裝有培養基的三角瓶中進行培養，每瓶接種一個外植體，每接種一個莖尖后都要將解剖針放在酒精燈上燒10 s，以降低操作中帶來的污染。培養基為添加不同種類、濃度生長調節劑的MS培養基，編號為1～9，另設不加任何生長調節劑的MS培養基作為對照，每種培養基中附加30 g/L蔗糖和6 g/L瓊脂，pH 5.8。培養基中植物生長調節劑配比見表2。培養條件為溫度25 ℃、光照強度2 000 lx、光照時間16 h/d。培養50 d后統計植株高度、葉片數、根數等。

1.4 病毒檢測

當莖尖苗長至6～7片葉時即可進行病毒檢測，檢測方法有血清學檢測、電鏡檢測和指示植物嫁接等，最快捷的檢測方法是電鏡檢測，可直接在電鏡下觀察到病毒質粒。去除檢測出的帶毒苗和品種特征改變或性狀變差的莖尖苗，剩余的即為脫毒苗，可直接用于快繁生產。

1.5 脫毒苗組培快繁

脫毒苗快繁可以采用試管苗單葉節扦插來進行，即在無菌條件下，將莖尖苗剪切成段，每段帶一節和一片葉，形態學下端扦插于加入生長調節劑的培養基中，通過生長調節劑的作用使莖段下端長出根，側芽向上萌發形成一棵完整的植株。試驗設計了10種加入不同種類、濃度生長調節劑的培養基，以不加任何生長調節劑的MS培養基作對照，篩選適宜的快繁培養基，每處理10個重復，每瓶接入3個節段，快繁培養基不同生長調節劑配比見表3。培養條件為：溫度28 ℃，光照強度2 000 lx，光照時間16 h/d，培養20 d后統計植株高度、葉片數、生根數等;得出適宜的培養基配方后，設置5個處理來篩選培養基中的糖用量，每個處理30瓶，培養20 d后統計株高、節間數和生根數等，結果見表4。

1.6 煉苗與移栽

甘薯脫毒苗在適宜的快繁培養基上一般20 d后可長成完整的植株，然后即可進行煉苗、移栽。煉苗時將裝有小苗的培養瓶移到15～20 ℃的培養室中放置5 d，第6天打開培養瓶用鑷子取出小苗，洗去根部殘留的瓊脂，再用0.1%的甲醛溶液浸泡10 min，然后以5 cm×5 cm的株行距栽入帶防蟲網棚的培養床上，栽培基質可用蛭石、珍珠巖、粗沙、爐灰渣、谷殼、鋸木屑等，移栽前7 d進行消毒。小苗栽好后立即用噴壺噴水，再用1/800～1/1 000百菌清或多菌靈噴淋，然后搭小拱棚并蓋上遮陽網，每天澆水1次，成活率可達98%以上。

2 結果與分析

2.1 "不同表面消毒方法對莖尖成活率和污染的影響

由表1可知，升汞的滅菌效果比次氯酸鈉好，乙醇和升汞結合起來滅菌可達到較好的效果，有效控制污染率，但升汞滲透性強，易損傷莖尖組織，在漂洗時需清洗5～6次，否則影響成活率。綜合不同處理滅菌和莖尖的成活率效果，處理③是最佳滅菌選擇。

2.2 不同莖尖培養基配方的效果

由表2可知，莖尖分生組織在不含生長調節劑的培養基中生長緩慢，成苗率低，成苗時間長。但在培養基中加入6BA、NAA后成苗率有了很大的提高，低濃度的6BA可促進莖尖分生組織分化出芽和根，高濃度的6BA則會使莖尖長出愈傷組織，影響成苗率;GA3能起到促使芽伸長的作用，在培養基中加入GA3后，可縮短成苗時間，50 d即可長成莖尖苗。

表2 不同生長調節劑培養基配比對莖尖組織生長的影響

處理6BA∥mg/LNAA∥mg/LGA3∥mg/L接種數∥個成苗數∥個成苗率∥%莖尖苗生長情況

CK0003026.67莖尖生長緩慢，90 d后成苗

①0.50.1030826.67莖尖淡黃色，開始大小無明顯變化

②0.50.20301240.00莖尖逐漸轉為綠色，開始生長

③0.50.3030413.33莖尖淡黃色，大小無明顯變化

④1.00.1030723.33莖尖基部產生愈傷組織

⑤1.00.20301033.33莖尖基部產生愈傷組織

⑥1.00.3030516.67莖尖基部產生愈傷組織

⑦000.2530620.00莖尖變為綠色，開始大小無明顯變化

⑧0.50.20.25301446.67莖尖綠色，30 d后開始生長

⑨2.00.2030413.37產生大量的愈傷組織，苗細弱，葉片小，葉色淺綠

2.3 病毒唑對莖尖苗脫毒率的影響

病毒唑是一種核苷結構的類似物，加入培養基中對病毒有抑制作用。試驗發現，在培養基中加入10 mg/L的病毒唑后，脫毒率可達到75.0%。

2.4 不同生長調節劑配比對甘薯脫毒苗快繁的影響

從表3可以看出，在組培快繁階段培養基中并不需要加入6BA，誘導生根起主要作用的生長調節劑是NAA。加入6BA會使莖段下端產生愈傷組織，生根數減少，側芽萌發后節間縮短，葉形變小，生長緩慢，煉苗時成活率低;而低濃度的NAA能促進脫毒苗生根，但濃度較高反而起到抑制作用，如NAA的濃度為0.3 mg/L時，脫毒苗剛開始生長迅速，快繁2～3代后卻出現葉片發黃、生長停止的現象。此外，在培養基中增加少量的泛酸鈣（2 mg/L）可促使脫毒苗生長迅速，葉片增多，20 d后即可進行一次快繁，從而提高繁殖系數。

2.5 不同糖用量對脫毒苗生長的影響

培養基中的糖是試管苗生長必不可少的碳源和能源，同時還具有調節滲透壓的作用。生產中為了節約成本，可用食用糖代替蔗糖。但不同糖用量對繁殖系數有影響，結果見表4。

由表4可知，培養基中不加入蔗糖時植株無生長，隨著糖用量從0增加到30 g/L，節間數也從1.0個增加到9.5個;但當糖用量超過30 g/L時，糖用量再增加，節間數增加卻不顯著，根的長度增加也較小，從快繁的角度而言，對增殖系數影響較大的是節間數，所以在甘薯快繁培養基中糖用量為30 g/L較為適宜。

2.6 適宜的培養條件

甘薯為喜溫作物，培養溫度在20 ℃以下時，脫毒苗生長較為緩慢，下部葉片變黃，溫度在28～30