茶云紋葉枯病拮抗放線菌的篩選

摘要 [目的]篩選出對茶云紋葉枯病菌有較好拮抗作用的拮抗放線菌。[方法]通過平板對峙培養法對茶云紋葉枯病的拮抗放線菌進行了篩選，并對其中拮抗效果較好的菌株進行了鑒定。[結果]從33株供試拮抗真菌中篩選獲得抑菌率明顯（大于50%）的放線菌2株，分別為F6和F10;經鑒定F6和F10均為鏈霉菌屬（Streptomyces）。[結論]為茶云紋葉枯病的生物防治提供了參考。

關鍵詞 茶云紋葉枯病;生物防治;拮抗作用;篩選;鑒定

中圖分類號 S435.711 "文獻標識碼

A "文章編號 0517-6611（2014）32-11339-03

Screening of Antagonistic Actinomycete for Tea Brown Blight Disease

LI Yingxiang1， WANG Weizhen2， TAN Xiaofeng3， WANG Yong2* et al "（1. The Tea Development and Management Office of Qiannan Miao Nationality Autonomic Eparchy， Duyun， Yunnan 558000; 2. Department of Plant Pathology， Agriculture College， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025; 3. Guizhou Plant Protection Station， Guiyang， Guizhou 550001）

Abstract "[Objective] The aim was to screen out antagonistic actinomycete for tea brown blight disease. [Method] Some antagonistic actinomycete against tea brown blight disease were screened through plate confrontation culture method and then identified. [Result] Two fungal strains （F6 and F10） whose inhibition ratio was above 50% were obtained from 33 strains. The identification result showed that they were both Streptomyces. [Conclusion] The results provide reference for the biological control of tea brown blight disease.

Key words Tea brown blight disease; Biological control; Antagonistic effect; Screening; Identification

茶云紋葉枯病又稱葉枯病、茶瘟病，是常見的葉部真菌病害之一，在全國各產茶區均有發生，屬高溫高濕病害[1]。茶云紋葉枯病的發生會嚴重影響茶葉的產量和品質，給產茶區造成很大損失，所以對該病進行防治十分必要。近年來食品安全和環境安全越來越受到人們的重視，人們更加重視利用生物防治來防治茶云紋葉枯病的可行性。為此，筆者利用微生物之間的相互作用，篩選了對茶云紋葉枯病菌有較好拮抗作用的拮抗放線菌，并鑒定出其種類，旨在為茶云紋葉枯病的生物防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試拮抗放線菌：分離于貴州省羊艾茶場茶葉根際土壤的放線菌，由貴州大學植物病理實驗室提供。放線菌用斜面法保存，挑取少量孢子于裝有燕麥瓊脂培養基的試管斜面上，密封試管，置于25 ℃培養箱中培養3～5 d，待放線菌的菌落長到一定大小后，將試管置于4 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的初篩。放線菌的篩選采用平板對峙培養法，但放線菌生長較慢，需將提前接于PDA培養基上3～5 d，待其菌落直徑達5 "mm左右，再將病原菌菌餅接入[2]。其他與拮抗真菌的篩選相同，計算對峙培養7 d后的抑菌率。

相對抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）× 100%[3]

1.2.2 拮抗菌的復篩。

通過初篩，選取抑菌率達到50%的拮抗放線菌進行復篩。復篩方法同“1.2.1”，每處理5次重復。

1.2.3 拮抗菌的鑒定。

放線菌的形態學鑒定參考陸錚錚等[4]的研究，主要依據放線菌在不同培養基上的培養性狀和孢子鏈特征進行。培養放線菌選用如下7種培養基[5]：高氏一號培養基、PDA培養基、燕麥瓊膠培養基、Czapck培養基、甘油天冬素瓊脂培養基、無機鹽淀粉瓊脂培養基和酵母精麥芽精培養基。觀察放線菌孢子鏈特征利用插片法[6]：①倒平板。將滅過菌的高氏一號瓊脂培養基溶化后，倒25～30 ml于無菌培養皿中，水平放置，制成厚5 mm左右的培養基平板。②插片。將無菌蓋片以45°左右的角度并排插入平板培養基中，插入深度為蓋片的1/3左右。③接種。用無菌接種環挑取放線菌孢子懸浮液接種于蓋片與瓊脂培養基的交界線上。在28 ℃下培養7 d左右。④觀察。用鑷子將蓋片小心取出，擦凈蓋片背面的培養基和生長較差的菌絲，放在載片上，將菌絲復蓋于載片上，在蓋片上加1滴香柏油，置于顯微鏡下直接觀察。

利用Biomiga公司生產的DNA提取試劑盒提取DNA后利用細菌的通用引物進行PCR擴增，引物為1492r/F27，擴增的片段送諾賽公司測序。真菌進行單向測序，放線菌進行雙向測序并拼接。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的初篩結果 通過對茶園土壤微生物的分離，獲得供試拮抗放線菌33株。通過初篩，獲得對峙培養7 d后能夠形成明顯抑菌帶的放線菌2株，分別為菌株F6和F10（圖1）。

表1 拮抗放線菌菌株的抑菌效果

菌株編號對照組直徑

cm處理菌落直徑

cm抑菌率

%

F66.862.2971.86

F106.864.2640.88

2.2 拮抗菌的復篩結果

通過復篩，發現初篩得到的2株放線菌均有較好的抑菌效果（表1）。

2.3 拮抗放線菌的鑒定結果 放線菌16S rDNA序列雙向測定拼接結果見圖2。

注：培養皿中上為拮抗放線菌，下為病原。

圖1 拮抗放線菌與病原對峙培養7 d的效果

圖2 放線菌16S rDNA序列雙向測定拼接結果

通過對比可知，F6菌株與多種鏈霉菌菌株的16S rDNA同源性達到99%;F10菌株與Streptomyces lunalinharesii strain 3551和Streptomyces ahygroscopicus isolate XSD109 2個菌株的同源性達到100%。要更加準確地鑒定菌株，需要結合培養特征、孢子絲和孢子特征進行鑒定。

放線菌形態學與培養特征結果（表2、圖3和圖4）：F6菌株在高氏一號培養基上氣生菌絲顯灰色，基生菌絲為淺灰色。孢子絲長而直，柔曲。F10菌株在高氏一號培養基上氣絲豐茂，絨粉狀，褐灰色至灰褐色，基絲淺黃色可溶性色素初無，日久淺黃色。孢子絲大部分緊密長螺旋形，5～8圈，有時2～3圈，孢子大部分球形至橢圓形，少數瓜子形、杏核形或檸檬形。

表2 拮抗放線菌在培養基上生長的特征（7 d后）

菌株

編號高氏一號氣絲基絲

ISP2氣絲基絲

ISP3氣絲基絲

IPS4氣絲基絲

IPS5氣絲基絲

Czapck氣絲基絲

PDA氣絲基絲

F6灰色淺灰色淺灰褐色淺灰黃色淺褐灰色灰黃色淺灰紅褐色褐色中等灰色灰黃色灰色灰白色灰白色褐灰色

F10灰色淺黃色白色淺黃色褐灰色藍灰色白色褐色灰色乳白色微灰色無色白色轉褐灰色淺黃色

注：A.孢子鏈;B.ISP2培養基上培養特征;C.ISP4培養基上培養特征;D.PDA培養基上培養特征。

圖3 拮抗放線菌F6形態特征及培養特征

注：A.孢子鏈及孢子絲;B.高氏一號培養基上培養特征;C.ISP3培養基上培養特征;D.ISP5培養基上培養特征。

圖4 拮抗放線菌F10形態特征及培養特征

綜合拮抗放線菌菌株的16SrDNA序列、 插片法觀察到形態學特征以及菌株在不同培養基上的培養性狀，初步將2株放線菌鑒定為鏈霉菌屬（Streptomyces）。其中F6鑒定為殺黃胞鏈霉菌（Streptomyces xanthocidicus），F10鑒定為不吸水鏈霉菌

（Streptomyces ahygrosconpicus）。

3 討論

試驗結果表明，從土壤中篩選到的放線菌對茶云紋葉枯病病原菌具有明顯的抑菌活性，具有開發為生物農藥的潛力。此外，運用DNA序列比較的方法比傳統的形態學研究更加簡便快速，并且準確度更高，必將成為今后放線菌鑒定的重要手段。

42卷32期 " " " " " " " "李應祥等 茶云紋葉枯病拮抗放線菌的篩選

參考文獻

[1]

陳生達. 茶云紋葉枯病的發病條件及防治方法[J]. 福建農業， 2005（2）：23.

[2] 方中達. 植病研究方法[M]. 北京：農業出版社， 1979：125-126.

[3] 范永強， 欒雨時， 馮璐. 越橘葉斑病原菌的拮抗菌篩選及其發酵條件優化[J]. 果樹學報， 2008， 25（3）：426-430.

[4] 陸錚錚， 彭麗娟， 丁海霞， 等. 煙草青枯菌拮抗放線菌的篩選及鑒定[J]. 煙草科學，2013， 34（2）：54-58.

[5] 陳國康， 陳世春， 肖崇剛， 等. 煙草根圍土壤對主要煙草病害的拮抗放線菌株篩選及其鑒定[J]. 西南大學學報：自然科學版， 2009， 31（12）：30-34.

[6] 蔡信之. 插片法觀察放線菌霉菌效果好[J]. 實驗教學與儀器， 1995（2）：28.