中草藥紅茶菌的制備及其體外抗口蹄疫病毒活性

摘要 [目的] 研究中草藥紅茶菌的細(xì)胞、乳鼠毒性以及對口蹄疫病毒在體外的抗病毒活性。[方法] 將中草藥紅茶菌過濾，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，分別接種在BHK21細(xì)胞上觀察細(xì)胞生長情況，評價其對細(xì)胞的毒性作用。將中草藥紅茶菌用滅菌水稀釋，分別接種3日齡乳鼠，觀察乳鼠生長、健康狀態(tài)和接種部位變化情況，評價其對乳鼠的毒性作用。用稀釋的中草藥紅茶菌與濃度為1 000 LD50的口蹄疫病毒等量混合，37 ℃條件下作用30 min，接種3日齡乳鼠，觀察乳鼠發(fā)病死亡情況，估算中草藥紅茶菌體外可殺滅口蹄疫病毒的最大使用濃度。用稀釋的中草藥紅茶菌與口蹄疫病毒混合，接種BHK21細(xì)胞，觀察致細(xì)胞病變效應(yīng)，記錄不同稀釋度的中草藥紅茶菌對口蹄疫病毒的殺滅效果。[結(jié)果]BHK21細(xì)胞和乳鼠試驗表明，中草藥紅茶菌在1 ∶4稀釋后，對BHK21細(xì)胞無毒性反應(yīng)，并可有效抑制1 000 TCID50 口蹄疫病毒在BHK21細(xì)胞生長繁殖；1 ∶2稀釋的紅茶菌微生態(tài)制劑對3日齡乳鼠無毒性反應(yīng)，并可有效殺滅1 000 LD50口蹄疫病毒。[結(jié)論] 中草藥紅茶菌是一種安全性好且對口蹄疫病毒有較好殺滅作用的口蹄疫預(yù)防中草藥微生態(tài)制劑。

關(guān)鍵詞 中草藥紅茶菌；口蹄疫病毒；預(yù)防；活性；體外

中圖分類號 S852.65+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05500-03

Abstract [Objective] To study the poisonous effects of Chinese herbal kombucha to cells and neonatl rat and its antiviral activity of FMDV in vitro. [Method] The filtered Chinese herbal Kombucha diluted with cell culture medium was inoculated in BHK21 cells， and its toxic effects on cells were observed and evaluated. The Chinese herbal Kombucha diluted with sterile water was inoculated with 3dayold suckling mice and its growth， health status and changes of vaccination site was observed， its toxic effects on suckling mice were evaluated. The diluted Chinese herbal kombuchaea is mixed with 1 000 LD50 of foot and mouth disease virus keeping for 30 min at 37 ℃， which is inoculated in 3dayold suckling to observe the incidence of neonatal mortality and estimate its maximum concentration of killing FMDV in vitro. The Chinese herbal kombucha mixed with FMDV is inoculated in BHK21 cells and its killing effects of FMDV are oberseved by recording cytopathic effects of different mixtures. [Result] BHK21 cells and suckling mouse tests showed： Chinese herbal Kombucha after 1 ∶4 dilution has no toxicity to BHK21 cells and could effectively inhibit the growth and reproduction of 1 000 TCID50 of FMDV in BHK21 cells； 1 ∶2 dilution of Chinese herbal kombucha has no toxicy on 3dayold suckling mice without toxicity and could effectively kill 1000 LD50 of FMDV. [Conclusion] Chinese herbal Kombucha is a safe and effective Chinese herbal probiotics for prevention and killing of FMDV.

Key words Chinese herbal Kombucha； FMD virus； Prevention； Aticity； in vitro

口蹄疫病毒屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬（Family Picornaviridae，Genus Aphthovirus），它為正鏈RNA病毒；口蹄疫病毒在全世界可分為彼此無交叉保護(hù)反應(yīng)的7個主型以及65個以上亞型[1]。 口蹄疫病毒感染偶蹄類動物造成口蹄疫疫情，這是一種急性、高度接觸性傳染病。雖然口蹄疫發(fā)病牲畜死亡率比較低，尤其是成年動物，但根據(jù)國際上控制口蹄疫的處理措施，對疫情發(fā)生地區(qū)將采取大規(guī)模撲殺以及貿(mào)易禁運，這些措施往往導(dǎo)致畜牧業(yè)大規(guī)模的經(jīng)濟損失。口蹄疫可以通過撲殺發(fā)病動物、禁止從口蹄疫疫區(qū)進(jìn)口動物等衛(wèi)生措施和使用疫苗來控制，但由于口蹄疫的高度傳染性、包含野生動物在內(nèi)的廣泛宿主以及病原體眾多的血清型使得口蹄疫防控變得困難[2]。這是因為口蹄疫病毒為RNA病毒，它的遺傳信息在自然進(jìn)化過程中變異很快[3-4]；甚至，在疫苗生產(chǎn)過程中，多次傳代繁殖病毒制備疫苗，造成制苗種毒發(fā)生新的變異，導(dǎo)致最終疫苗種毒可能不能提供所需的抗原覆蓋率[5]。因此，至今口蹄疫的預(yù)防依然是一個畜牧疫病研究的重要難題。

口蹄疫病毒對酸特別敏感[6-7]。根據(jù)口蹄疫病毒對酸的敏感性，研制出各種酸性消毒劑，通過噴霧消毒來預(yù)防口蹄疫。但這些消毒作用均是瞬時性的。消毒過后，外面的口蹄疫病毒依然可以通過呼吸道和消化道侵染易感動物。紅茶菌是一種包含醋酸菌、酵母菌為主、產(chǎn)酸能力很強的共生菌群，它能在醋酸菌、酵母菌的共生作用下產(chǎn)生醋酸、檸檬酸、葡萄糖酸等酸性物質(zhì)，紅茶菌培養(yǎng)液pH一般保持在2.5～4.5[8]。紅茶菌對人體胃腸道的保健機理之一就是依靠降低胃腸道的pH來抑制病原菌的生長[9] 。茶葉、羅漢果、甘草、野菊花是一些具有藥食兩用的中草藥植物，這些植物的提取液普遍具有提高動物免疫力、拮抗病原細(xì)菌、病毒等方面的作用。因此，如果利用紅茶菌發(fā)酵上述茶葉等提取液來制備微生態(tài)制劑，將這種中草藥紅茶菌噴入這些口蹄疫病毒易感動物的呼吸道和消化道，紅茶菌中的復(fù)合菌群將通過產(chǎn)生醋酸等有機酸來降低這些口蹄疫病毒感染途徑的pH，同時在茶葉等中草藥提取液的協(xié)同作用下將能有效預(yù)防口蹄疫的發(fā)生。筆者在此報道了這種中草藥紅茶菌的制備、中草藥紅茶菌體外抗口蹄疫病毒活性以及臨床應(yīng)用預(yù)防口蹄疫的試驗結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 中草藥紅茶菌的制備以及檢測

所用紅茶菌菌種購自北京食品研究所。紅茶菌母液的制備參考呂愛軍等提供的方法[10]。制備中藥提取液是將0.2%茶葉、0.5%甘草、0.2%羅漢果和0.2%野菊花放入水溶液中煮沸，過濾后冷卻到約30 ℃以下時加入20%紅茶菌母液，靜置發(fā)酵2周后用于檢測或臨床使用。采用島津分析重金屬等離子發(fā)射光譜儀ICPS7510檢測紅中草藥紅茶菌中的重金屬，它的醋酸菌、酵母菌、大腸桿菌、沙門氏菌含量等指標(biāo)采用常規(guī)的平板計數(shù)法檢測，pH用FE20型pH計測量。

1.2 中草藥紅茶菌對BHK21細(xì)胞和乳鼠安全性試驗

1.2.1 中草藥紅茶菌對BHK21細(xì)胞安全性試驗。

BHK21細(xì)胞系，從中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所引進(jìn)，實驗室傳代保存；3日齡昆明系小白鼠（乳鼠），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心提 供。將中草藥紅茶菌在無菌環(huán)境下用微孔過濾器（0.22 μm）過濾后，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成1 ∶2、1 ∶4、1 ∶10等3個稀釋度，與過濾后的原液共4組，分別接種生長良好的單層BHK21細(xì)胞，每個稀釋度接種8孔，50 μl/孔，37 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，評價其對細(xì)胞的毒性作用。陰性對照組直接接種細(xì)胞培養(yǎng)液。試驗重復(fù)2次。

1.2.2 中草藥紅茶菌對乳鼠安全性試驗。將中草藥紅茶菌用滅菌水稀釋成1 ∶2、1 ∶4、1 ∶10等3個稀釋度，與未經(jīng)任何處理的原液共4組，分別接種3日齡乳鼠，0.2 ml/只，每組接種5只，觀察乳鼠生長、健康狀態(tài)和接種部位變化情況，評價其對乳鼠的毒性作用。陰性對照組接種滅菌水。試驗重復(fù)2次。

1.3 中草藥紅茶菌對口蹄疫病毒殺滅效果測定

1.3.1 中草藥紅茶菌殺滅口蹄疫病毒的預(yù)試驗。口蹄疫病毒株O/China/99培養(yǎng)、擴繁、種子批制備等方法按照中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動物生物安全三級實驗室《口蹄疫實驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）》相關(guān)文件進(jìn)行；毒價測定按照ReedMuench法進(jìn)行。用1 ∶10、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000倍稀釋的中草藥紅茶菌與濃度為1 000 LD50（LD50表示50%乳鼠致死的病毒劑量）的口蹄疫病毒等量混合，37 ℃條件下作用30 min，接種3日齡乳鼠，0.2 ml/只，每組4只，觀察乳鼠發(fā)病死亡情況，連續(xù)觀察7 d。重復(fù)2次，估算中草藥紅茶菌體外可殺滅口蹄疫病毒的最大使用濃度。陽性對照為1 000 LD50稀釋的病毒液，陰性對照為最低稀釋度的中草藥紅茶菌。陽性對照應(yīng)于48 h以內(nèi)因口蹄疫病毒感染而全部致死，陰性對照應(yīng)不出現(xiàn)任何不良反應(yīng)。

1.3.2 BHK21細(xì)胞試驗。結(jié)合細(xì)胞安全性試驗和預(yù)試驗，采用方陣交叉反應(yīng)滴定法，選取2倍梯度稀釋中草藥紅茶菌，與10倍梯度稀釋的細(xì)胞毒等體積混合（每孔各加50 μl），37 ℃作用60 min，接種BHK21細(xì)胞，觀察致細(xì)胞病變效應(yīng)。同時設(shè)立100 TCID50、1 TCID50和0.1 TCID50（TCID50表示檢測細(xì)胞50%致死的病毒劑量）的病毒回歸對照各4孔，每孔加病毒液50 μl；中草藥紅茶菌每稀釋度的細(xì)胞毒性對照各4孔，不加病毒液；正常細(xì)胞對照4孔，不加病毒液。連續(xù)觀察72 h，100 TCID50孔應(yīng)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)，0.1 TCID50和細(xì)胞毒性對照以及正常細(xì)胞對照均不出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)。重復(fù)3次，記錄不同稀釋度的中草藥紅茶菌對口蹄疫病毒的殺滅效果。

1.3.3 乳鼠試驗。結(jié)合乳鼠安全性試驗和預(yù)試驗，選取適當(dāng)稀釋度中草藥紅茶菌與1 000 LD50的口蹄疫病毒等量混合，37 ℃條件下作用30 min，接種3日齡乳鼠，0.2 ml/只，每組4只，觀察乳鼠發(fā)病死亡情況，連續(xù)觀察7 d。重復(fù)3次，計算中草藥紅茶菌體外可殺滅口蹄疫病毒的最大濃度。陽性對照為1 000 LD50稀釋的病毒液，陰性對照為最低稀釋度的中草藥紅茶菌。陽性對照應(yīng)于48 h以內(nèi)因口蹄疫病毒感染而全部致死，陰性對照應(yīng)不出現(xiàn)任何不良反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥紅茶菌的制備以及檢測

經(jīng)過上述制備工藝，獲得中草藥紅茶菌，該產(chǎn)品的各項檢測指標(biāo)如表1所示。從表1可以看出，中草藥紅茶菌具有很強的酸性（pH=2.75），表明紅茶菌具有很強的產(chǎn)酸特性；由于中草藥紅茶菌既包含茶葉、羅漢果、甘草等提取液和益生生菌的成分，茶葉等提取液的成分對醋酸菌、酵母等有抑制作用，所以益生菌含量偏低；中草藥紅茶菌其他各項目指標(biāo)如重金屬指標(biāo)、雜菌指標(biāo)是合格的，沒有病原菌沙門氏菌的檢出。

2.2 中草藥紅茶菌安全性試驗結(jié)果

按照ReedMuench法測定，試驗用毒株對乳鼠半數(shù)致死量（LD50）為10-8.0/0.2ml，對細(xì)胞毒半數(shù)感染量（TCID50）為10-7.0/50 μl。

經(jīng)過濾中草藥紅茶菌原液、1 ∶2、1 ∶4、1 ∶10稀釋液，分別接種單層BHK21細(xì)胞后，24 h觀察到原液和1 ∶2稀釋液接種的細(xì)胞100%死亡，1 ∶4和1 ∶10稀釋液接種的細(xì)胞正常生長，未見細(xì)胞毒性反應(yīng)；重復(fù)2次結(jié)果一致。由此可見，中草藥紅茶菌經(jīng)1 ∶4稀釋或更高倍數(shù)稀釋后，接種BHK21細(xì)胞，對細(xì)胞無毒性反應(yīng)。從中草藥紅茶菌對乳鼠安全性試驗結(jié)果（表2）可以看出，乳鼠在接種中草藥紅茶菌原液后，肉眼可見微弱毒性反應(yīng)；在接種1 ∶2及更高稀釋度后，乳鼠全部健活，表現(xiàn)為安全。

3 討論

紅茶菌是一個以醋酸菌、酵母菌為主的復(fù)合共生菌群，因此，相對于單一的菌種或非共生的菌群，它具有很強的存活能力；由于它能產(chǎn)生乙酸、葡萄糖酸、乳酸等有機酸類物質(zhì)，因此具有很強的拮抗其他病原微生物的能力，如紅茶菌菌液能有效抑制枯草芽抱桿菌（ B.subgilis）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）以及幽門螺旋桿菌（H.pylori）等[9-10] 。 根據(jù)口蹄疫病毒對酸敏感的特性以及高濃度的中草藥紅茶菌對口蹄疫病毒的抑制和殺滅試驗結(jié)果，推測中草藥紅茶菌中的有機酸對口蹄疫病毒的殺滅應(yīng)起到主效作用，同時也與廣譜性的抗病毒植物茶葉、甘草、羅漢果等的提取液有關(guān)，如其中的甘草提取液中的甘草多糖可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生干擾素來提高動物機體的抗病毒特性[11-12]。

筆者以前在豬上的口噴和鼻噴中草藥紅茶菌的試驗結(jié)果表明，使用一次中草藥紅茶菌，在一周之內(nèi)，從豬的糞便中分離出大量醋酸菌。表明紅茶菌中的醋酸菌和酵母復(fù)合共生菌群在豬的消化道中能存活能長達(dá)1周或更長的時間。 因此，可推測中草藥紅茶菌中的醋酸菌、酵母等益生菌在動物的呼吸道以及消化道存活較長時間，這些益生菌能夠持續(xù)產(chǎn)生醋酸等有機酸來抑制和殺滅口蹄疫病毒，從而實現(xiàn)對口蹄疫相對較為長效的預(yù)防。由于這種有效預(yù)防時間僅為1～2周的時間，所以需要周期性（如每周一次）使用這種中草藥紅茶菌，才能實現(xiàn)對口蹄疫的長效預(yù)防。除了抗口蹄疫病毒的特性，這種中草藥紅茶菌具有一般微生態(tài)制劑的優(yōu)良特性，如無毒、環(huán)保、促進(jìn)生長、提高動物的免役力等優(yōu)良特性，因此這種多功能性將有助于促進(jìn)這種中草藥紅茶菌在生產(chǎn)中的推廣和應(yīng)用。由于目前尚無醋酸菌、酵母共生菌群在豬、牛等動物呼吸道存活時間的相關(guān)研究數(shù)據(jù)，進(jìn)一步的相關(guān)研究將揭開中草藥紅茶菌對口蹄疫高效預(yù)防的作用機理。 利用中草藥紅茶菌預(yù)防口蹄疫，可以立即生效，無任何遲滯期。因此，除了平時使用預(yù)防外，還可以用于對口蹄疫疫區(qū)的應(yīng)激性預(yù)防。最近有報道稱注射干擾素表達(dá)載體可以有效預(yù)防口蹄疫，但這種方法最短也有24 h的遲滯期，而且平時也不可能經(jīng)常性的注射這種病毒載體[13-14] 。

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