醫用再生絲素蛋白膜的制備及性能研究

摘要 [目的]以再生絲素蛋白為原料，制備致密再生絲素蛋白膜，通過優選改性方法使得該膜具備一定的力學性能和不溶性、合適的降解速度等，以滿足將來在子宮內膜修復中的應用要求。[方法]將蠶絲脫膠、溶解得到再生絲素溶液，采用流延法鋪膜，并用無水乙醇和濃度0.1%戊二醛進行不溶化處理，用蛋白酶XIV進行降解試驗，利用萬能拉伸機、FESEM、FTIR和失重法等方法對絲素蛋白膜的微觀形貌、力學性能、蛋白構象和降解性等進行測試。[結果]由再生絲素溶液可制備光滑致密的絲素蛋白膜，經乙醇和戊二醛處理后，絲素分子中β-折疊結構增多，無規卷曲結構減少，其力學性能增強，降解速度減慢。蛋白酶XIV可加速其降解。[結論]再生絲素蛋白膜在作為物理屏障用于預防和減少術后組織黏連方面有著極大的可能性。

關鍵詞 絲素蛋白膜；構象；酶降解

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05355-03

Abstract [Objective] Dense regenerated silk fibroin films were prepared. The films have good biocompatibility， appropriate mechanical property and regulated degradation velocity via optimal method of posttreatment. [Method] B. mori silk cocoons were degummed and solubilized to obtain regenerated silk solution， and then regenerated silk films were fabricated using tapecasting method. Pure ethanol solution and 0.1% glutaraldehyde were selected to improve crosslinking of SF molecular. SF degradation experiment was carried out in protease XIV solution. The microstructure， protein conformation and degradability， mechanical property of regenerated SF films were characterized using FESEM， FTIR， weightloss method and Instron Tensile Machine etc. [Result] Obtained SF films were smooth and dense， the βsheet conformation content of SF films increased and random coil conformation content decreased after treatment by pure ethanol and glutaraldehyde. Both modified SF films had higher mechanical properties and slower degradation speed. [Conclusion] Silk fibroin film was a potential biomedical barrier as antiadhesive materials to reduce the presence and extent of intrauterine adhesions.

Key words Silk fibroin films； Conformation； Enzymatic degradation

隨著人類生活節奏的加快，由于各種因素所導致的婦產科疾病的發病率呈逐年上升的趨勢，并且各種婦科腫瘤發病年齡趨于年輕化。近年來，盆腹腔手術日益增多。但是，術后可能出現的組織黏連嚴重影響了手術效果和患者生活質量，加重了患者的經濟和精神負擔。據報道，67%～93%盆腹腔手術[1]會導致組織黏連，局部的黏連會導致嚴重的臨床并發癥如腸梗阻、不孕癥和慢性盆腔疼痛等，常需再次乃至多次手術治療[2]。黏連的發生機理非常復雜，涉及多種生化、細胞因子和病理改變，但最終都可以歸結為纖維蛋白的沉積超過了纖維蛋白的溶解[3]。現有的術后防黏連材料主要有聚乳酸防黏連凝膠、聚乳酸防黏連膜、透明質酸鈉凝膠和醫用殼聚糖膜四大類[4]。但是，就目前來看，它們或多或少都有些弊端，例如聚乳酸材料的降解物易引起患者腹痛、發熱等，且其凝膠在體內的存留時間較長，其膜的貼附性差，易滑離；透明質酸鈉屬于液態易流動物質，受體位的影響，易流出體外；醫用殼聚糖同樣受體位的影響，且材料活性的保持時間較短，因此有必要研發新型防黏連材料。絲素蛋白作為天然高分子具有來源廣、無毒、無污染、無刺激、生物相容性好及可降解等優點。若以此為基質，制備再生絲素蛋白膜，一方面可以起物理阻隔作用，另一方面其自身的內部結構可以引導細胞的生長，促進內膜形態結構、功能的恢復[5]。為此，筆者研究了再生絲素蛋白膜的制備，重點討論了絲素膜的力學性能、蛋白構象、降解性等特征，以期為再生絲素蛋白膜的實際投入應用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試桑蠶繭由湖州澳特斯生物科技有限公司提供；溴化鋰（LiBr）、戊二醛（GA，50%水溶液）購于上海阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇（C2H5OH）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、透析袋（截流分子量8 000～14 000）、PEG（分子量20 000）由杭州匯普化工儀器有限公司提供；灰色鏈霉菌蛋白酶（protease XIV）由北京北實縱橫科技發展有限公司提供。

1.2 試驗方法

將經過脫膠的絲素纖維溶解于9.3 mol/L的LiBr溶液中，絲素蛋白纖維與溶液的質量體積比為1 ∶4（12.5 g纖維溶于50 ml溶液中），放入65 ℃恒溫培養箱中振蕩1 h，同一溫度下靜置溶解0.5 h，透析3 d，每隔12 h更換一次去離子水，然后于4 ℃冰箱保存備用。

將所得再生絲素溶液過濾，并用去離子水稀釋至濃度5%，在下列條件下處理得到3種再生絲素蛋白膜。①取4 ml濃度5%的絲素溶液，澆鑄在聚乙烯盤中，于60 ℃烘箱中烘3.5 h；②取部分上述所得膜，浸泡在無水乙醇中24 h，待乙醇揮發后干燥保存；③在絲素溶液中加入濃度0.1%戊二醛，低速攪拌5 min，再取4 ml該溶液澆鑄在聚乙烯盤中，于60 ℃烘箱中烘3.5 h。將所制得的絲素膜用鈷60伽馬射線輻射滅菌后備用。

將一定量鏈霉菌蛋白酶溶解在適量的去離子水中，得到0.1 U/ml降解用蛋白酶溶液[6-7]。將5 mg再生絲素蛋白膜加入于1 ml中性蛋白酶溶液中浸泡，同時準備再生絲素蛋白膜樣品，置于PBS緩沖溶液中作為空白對照組。每24 h更換新鮮的酶溶液以保持酶的高活力，空白對照組每隔3 d更換PBS溶液。每個樣品設5個平行樣。在規定的時間點（第1、4、7、10、13、16天）取出樣品，經充分洗滌后，稱重，記錄降解以后的質量。

所有的絲素膜樣品的處理方法、編號見表1。

1.3 材料性能表征

將滅菌后的再生絲素蛋白膜制成40 mm×10 mm試樣，用Instron 3367型萬能拉伸機對其進行力學性能測試。其中，樣品厚度為40 μm，測試溫度為室溫，夾持長度為20 mm，走樣速度為6 mm/min，平行樣5個以上[6]。將降解前后的再生絲素蛋白膜固定于樣品臺，經真空鍍金后，用掃描電子顯微鏡觀察樣品的表面和斷面形貌。采用Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀，用全反射傅里葉紅外光譜分析（ATR）分析降解前后再生絲素蛋白膜的構象變化，測定范圍為4 000～8 00 cm-1，分辨率為4 cm-1。

2 結果與分析

采用乙醇和戊二醛對絲素膜進行不溶化處理，并且對其力學性能進行了分析。由圖1可知，添加戊二醛制備的絲素膜與經乙醇表面處理所得絲素膜的斷裂強度相對未經處理的絲素膜有明顯的提高，且提高的程度相差不大。這是因為添加戊二醛后，戊二醛的2個醛基可以與絲素分子形成共價交聯，增強絲素分子間的相互作用力，從而使得絲素膜的拉伸強度提高[7]；乙醇表面處理則能使蛋白質變性，使得絲素蛋白的二級結構由無規向β折疊結構轉變[8]，因而斷裂強度得以增加。但是，這2種處理方法對絲素膜斷裂伸長提高的影響不大。

滅菌前后絲素蛋白膜的構象變化如圖2所示。未經處理的再生絲素蛋白膜A-1在1 645、1 530和1 236 cm-1附近有特征吸收峰，分別代表絲素蛋白的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ區，表明絲素分子的蛋白構象以無規卷曲為主。絲素膜經乙醇表面處理（B-1）后，酰胺Ⅱ的特征吸收峰偏移到1 520 cm-1處。這是silkⅡ結構的特征吸收峰，表明絲素分子的蛋白構象由原先的無規卷曲向β折疊構象轉化[9-10]。添加戊二醛的絲素膜C1與未經處理的絲素膜相比，在1 520 cm-1處有出現新峰的趨勢，表明絲素膜中的無定型結構含量減少，silkⅡ結構含量增加。從圖2還可以看出，3種絲素膜在未滅菌前，1 625 cm-1均有特征吸收峰，經滅菌處理后該處的特征吸收峰都消失了，而此處吸收峰歸屬于蛋白質的β-折疊構象。這說明γ射線輻照減少了絲素中的silkⅡ結構，使得絲素的無規結構增多，對絲素分子的蛋白結構有一定的影響。

由圖4可知，在蛋白酶XIV降解液中浸泡16 d后，3種絲素膜的質量下降幅度明顯，均比浸泡在PBS緩沖溶液中大，說明蛋白酶XIV能有效降解再生絲素蛋白膜材料。同時，在2種降解體系中，未經處理的絲素膜的失重率最大，其次為添加戊二醛的絲素膜，而經乙醇處理的絲素膜的失重率最小。這是因為降解從非結晶區開始，無規線團部分易被降解掉，而結晶區中的silkⅡ結構則較難被降解，絲素膜中不同的結構以及它們在材料中所占的比列對膜材料的降解速率有很大的影響[11]。添加戊二醛后，醛基與絲素分子形成共價交聯，增強了分子間作用力，無規卷曲的結構減少，silkⅡ的結晶結構增加，因此其降解速度比未經處理的絲素膜慢。而絲素膜經乙醇表面處理后，蛋白構象也由無規向β折疊結構轉變，且它的silkⅡ結構所占比重可能比添加戊二醛的絲素膜要大，因此它的失重率在三者中最小。

降解后絲素蛋白膜的表面形貌發生了顯著變化。由圖6可知，絲素膜A3在PBS緩沖溶液中降解16 d后，表面變得略微粗糙，斷面邊緣有少許裂紋，說明絲素膜的確發生了降解，且邊緣處降解較厲害。在蛋白酶XIV溶液中降解的絲素膜A4則變化更為明顯，降解16 d后表面變得疏松，斷面邊緣也有更多的鋸齒狀降解紋。這說明蛋白酶XIV確實能加速降解絲素蛋白膜。經乙醇處理的絲素膜也有此規律，且表面變化更顯著。在PBS溶液中降解的膜B3表面呈現疏松結構，在酶溶液中降解的膜B4表面變成具有密集微孔結構的粗糙表面，而它的失重率比未處理的絲素膜要小。這是因為兩者的降解機理不同，未處理的絲素膜在降解時是作為整 體一起降解的，降解后的表面比較均一，在放大倍數較低 的情況下觀察到的是較平整的表面；而經乙醇表面處理過的絲素膜具有較多的silkⅡ結構，其降解是從一些薄弱點開始的，很快形成一些裂縫，再慢慢往內降解，因此它的表面會顯得更加粗糙。添加戊二醛的絲素膜C3在PBS緩沖溶液中降解后表面仍比較光滑，斷面邊緣有比較突出的皺褶，說明該膜降解主要從邊緣開始。蛋白酶降解后的膜C4表面變得疏松，但比未處理的略好。

3 結論與討論

蠶絲經脫膠溶解后，采用流延干燥法可制得光滑致密的再生絲素蛋白膜。經無水乙醇和濃度0.1%戊二醛不溶化處理后，絲素膜的力學性能得到提高，且分子中的β折疊結構增多，無規卷曲結構減少。鈷60伽馬射線輻射滅菌對絲素分子的蛋白結構有一定的影響，減少了絲素中的silkⅡ結構，使得絲素的無規結構稍有增加。另外，降解試驗表明，蛋白酶XIV能降解再生絲素蛋白膜材料，降解16 d后絲素膜最大失重可達約60%。同時，經無水乙醇表面處理的絲素膜失重率最小，其次為戊二醛處理的樣品，未處理的絲素膜失重率最大。該研究表明，通過合適的處理方法可以調整絲素蛋白膜的降解速度，以滿足其在子宮修復膜中的應用要求。

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