高效液相色譜法檢測人參培養須根及內生菌中皂苷的含量

摘要 [目的]檢測人參培養須根及內生菌中皂苷的含量。[方法]采用高效液相色譜法同時測定植物生物反應器中人參培養須根及內生菌中10種人參皂苷單體的含量。液相體系為：Waters Symmetry C18 Synergi色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，以乙腈為流動相A，超純水為流動相B進行梯度洗脫，檢測波長203 nm，進樣量10 μl。[結果]10種皂苷基本分離，線性關系良好，穩定性、精密度和重復性均較好，平均回收率在95.07%～108.72%。[結論]該方法快速簡便，重現性好，可對人參培養須根及內生菌中皂苷含量進行多指標質量控制。

關鍵詞 人參培養須根；內生菌；人參皂苷；皂苷含量測定；高效液相色譜法

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05418-04

Abstract [Objective] To measure the ginsenosides content in ginseng cultivation fibrous and endophytes. [Method] High Performance Liquid Chromatographic（HPLC）method was used for the simultaneous determination of 10 kinds of ginseng saponin monomer in plant bioreactors of ginseng root and ginseng endophytes. The chromatographic separation was performed on a Water Symmetry C18 Synergi column（250 mm×4.6 mm，5 μm）and the column temperature was set to 30 ℃， then let acetonitrile as the mobile phase A， B ultrapure water as the mobile phase to gradient elution， also we set the detection wavelength to 203 nm and the injection volume 10 μl. [Result]

The results showed that we can basic separation of 10 kinds of saponins， and the linear relationship is good， also we can find that the average recovery range of 95.07% to 108.72%. [Conclusion] The method is simple， reproducible， ginsenosides content in ginseng root and ginseng cultivation endophytes can be controlled with multiindicators.

Key words Ginseng cultivation fibrous； Endophytes； Ginsenosides； Determination of saponin； High Performance Liquid Chromatographic method

人參（Panax ginseng C.A.Mey.）屬五加科人參屬多年生藥用草本植物，是傳統名貴中藥。人參具有很高的藥用價值，人參皂苷是其主要藥效成分。現代藥理學研究認為，人參不僅對中樞神經、心血管、免疫、內分泌系統等方面具有藥理作用，還表現出抗腫瘤、抗應激、抗氧化活性和強勁的抗真菌活性[1]。由于人參的主要活性成分是人參皂苷，所以人參皂苷的含量一般被認為是評價人參內在質量的主要指標。

關于人參皂苷測定的標準，2010年版的《中華人民共和國藥典》[2]中規定以高效液相色譜法測定干燥樣品含人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總量不得少于0.30%，人參皂苷Rb1不得少于0.20%作為人參的質量標準。近年來根據該標準，已有不少關于測定人參藥材及復方中人參皂苷的含量研究報道，如林世和等[3]通過建立新的HPLC方法來測定人參蘆中人參皂苷Rb1、Rg1、Re的含量，許乾麗等[4]利用HPLC方法測定益心舒膠囊中的人參皂苷Rb1、Rg1、Re的含量，馮中等[5]則對不同廠家復方丹參片中三七皂苷R1和人參皂苷Re、Rg1、Rb1含量進行HPLC測定，而chen等[6]利用HPLC-MS對人參皂苷Rg1、Re進行快速分離提取及含量測定。但根據該標準所測定的人參皂苷成分比較單一，很難反映藥材整體質量的優劣。也有對3種以上人參皂苷進行同時測定，只是分析時間較長，條件繁瑣，有些皂苷也沒有很好的分離出來[7-8]。人參皂苷Rb1、Rb2、Re、Rd、Rc、Rf、Rg1、F2、Rg3、Rh2為人參中的主要皂苷類成分，具有重要的藥用價值。如果能夠摸索出一個同時測定這10種人參皂苷單體的HPLC體系，將對評價產物人參皂苷質量具有重要促進作用。

項目組一直以來進行利用人參培養須根和內生菌生產人參皂苷的課題。因此筆者開發了一組同時測定上述10種人參皂苷含量的液相體系，利用該體系對生物反應器培養的人參培養須根及內生菌生產人參皂苷[9]進行分析，達到很好的定性定量效果，以期為人參培養須根及內生菌中人參皂苷質量進行多成分指標綜合評價提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。不同批次的人參初代培養根，為韓國江原道野生山參（Panax ginseng C.A.May.）的須根（韓國江原大學山林科學學院崔龍義教授鑒定）誘導而來，繼代用無菌培養須根由東北林業大學生命學院由香玲教授提供。

1.1.2 主要儀器。Waters e26952998液相色譜系統，購自Waters公司；DHAUS AR2140電子天平和FW135中草藥粉碎機，購自天津市泰斯特儀器有限公司；N-1001旋轉蒸發儀，購自上海愛朗儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑。人參皂苷Rb1（41753439，HPLC≥98%）、Rb2（11021139，HPLC≥98%）、Re（51542564，HPLC≥98%）、Rf（52286585，HPLC≥98%）、Rg1（22427390，HPLC≥98%）、F2（62025494，HPLC≥98%），Rh2（111764 200601，HPLC≥98%），Rc（11021140，HPLC≥98%），Rd（52705938，HPLC≥98%），Rg3（110804-200603，HPLC≥98%）對照品，均由中國藥品生物制品檢定所提供。乙腈為色譜純（DIKMA），水為超純水，甲醇為色譜純（DIKMA），市售。

1.1.4 供試菌種。G22[9]，由實驗室從龍牙楤木提取獲得的內生菌。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件。色譜柱為Waters Symmetry C18 Synergi（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；以乙腈為流動相A，超純水為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫；檢測波長為203 nm；進樣量為10 μl。

1.2.2 對照品溶液的制備。精密稱取適量人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2對照品，加濃度100%甲醇稀釋制得濃度0.2 mg/ml的人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2的混合對照品溶液。

1.2.3 方法學考察。（1）系統適應性試驗。取適量對照品溶液、供試品溶液和G22溶液，按上述色譜條件進樣，測定系統適用性。（2）線性關系的考察。精密稱取對照品適量制成混合對照品溶液，分別精密吸取對照品溶液10、20、30、40和50 μl進樣測定，以含量值X為橫坐標，峰面積積分值Y為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性回歸方程。（3）試驗精密度。精密吸取上述對照品溶液10 μl，連續進樣6次，記錄峰面積，根據所得峰面積考察精密度。（4）試驗重復性。精密稱取6份同一批次人參藥材樣品各1.000 g，制備6份供試品溶液，按上述色譜條件分別進行進樣測定，計算各成分含量和RSD。（5）試驗穩定性。精密稱取同一供試品溶液，在上述色譜條件下分別于0、2、4、6、8、12和24 h進樣測定，計算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2峰面積的RSD。（6）試驗回收率。精密量取已知含量的供試品溶液0.8 ml，精密加入 “1.2.2” 項下混合對照品溶液0.8 ml，搖勻。平行制備6份供試品溶液，并按上述色譜條件進行進樣測定。計算人參皂苷的平均回收率和RSD。

1.2.4 人參培養須根皂苷的提取。（1）干燥。將收獲的人參培養須根放入烘箱中干燥，溫度設置為50 ℃。（2）粉碎。將干燥后的材料放入中草藥粉碎機中打成粉末狀，并在電子天平上精確稱取1.000 g。（3）萃取。稱取后的材料置于50 ml離心管中，精密加入25 ml濃度80%的甲醇，蓋嚴，超聲萃取（65 ℃，100 HZ）50 min，每10 min晃動搖勻一次，取上清液，轉移上清液至新的離心管。向底物中重新加入25 ml甲醇重復萃取1次，合并上清液。（4）離心。高速離心5 min（3 000 r/min），取上清液進行蒸發。（5）蒸發。用旋轉蒸發儀（80 ℃，80 r/min）旋轉蒸發提取液提取皂苷。（6）過濾。得到的干燥物用2 ml濃度20%的乙腈溶解，搖勻，用一次性過濾器濾過，取濾液，該濾液即為供試品溶液。

1.2.5 內生菌G22皂苷的提取。（1）萃取：將25 ml菌液置于50 ml離心管中，精密加入25 ml濃度100%的乙酸乙酯，蓋嚴，超聲萃取（65 ℃，100 hz）50 min，每10 min晃動搖勻1次，取上清液，轉移上清液至新的離心管。向底物中重新加入25 ml乙酸乙酯重復萃取1次，合并上清液。（2）離心。高速離心5 min（3 000 r/min），取上清液進行蒸發。（3）蒸發。用旋轉蒸發儀（80 ℃，80 r/min）旋轉蒸發提取液提取皂苷。（4）過濾。得到的干燥物用2 ml濃度20%的乙腈溶解，搖勻，用一次性過濾器濾過，取濾液，該濾液即為供試品溶液。

1.2.6 樣品測定。按上述供試品的制備方法和色譜條件，測定不同批次人參培養須根樣品和內生菌G22中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2總量，重復3次。

1.2.7 數據分析。所有生化分析數據均用Excel 2007進行數據處理和圖表繪制，色譜圖片由液相軟件Empower 3直接截圖而來。

2 結果與分析

2.1 方法學考察 （1）系統適應性試驗。圖1～3表明，對照品溶液和供試品溶液在相同的保留時間上有對應的吸收峰，且分離度良好，表明系統適應性良好。（2）線性關系的考察。由表2可知，在各自范圍內，人參皂苷濃度與峰面積的線性關系良好。（3）試驗精密度。計算得人參皂苷Rg1峰面積的RSD為2.24%，Re峰面積的RSD為1.32%，Rf峰面積的RSD為1.66%，Rb1峰面積的RSD為1.39%，Rc峰面積的RSD為1.28%，Rb2峰面積的RSD為1.33%，Rd峰面積的RSD為0.71%，F2峰面積的RSD為1.97%，Rg3峰面積的RSD為1.75%，Rh2峰面積的RSD為2.08%，表明儀器精密度良好。（4）試驗重復性。計算得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2總量的含量平均值為7.71 mg/ml，RSD均小于3.0%，說明該方法重復性良好。（5）試驗穩定性。計算得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2峰面積的RSD在0.71%～2.24%，表明該供試品溶液在24 h內穩定性良好。（6）試驗回收率。由表3可知，各人參皂苷平均回收率均在95.07%～108.72%，RSD<3%，說明方法回收率良好，可用于人參培養須根及內生菌中皂苷含量進行多指標質量控制。

3 討論

3.1 指標的選擇 研究表明，人參中有多種成分具有抗氧化、抗應激、抗腫瘤等活性，其中主要活性成分是人參皂苷。2008年發布的國家標準GB/T 22996-2008給定了6種人參皂苷單體的測量方法，這6種皂苷分別為人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1、Rc、Rb2，而2010年中國藥典給定了人參皂苷Rg1、Re、Rb1的測定方法。通常研究者們根據國家標準和自己研究的側重點選取不同人參皂苷單體作為測量目標[8，10]。經過項目組對人參皂苷成份功能的分析，選取了10種人參皂苷來進行試驗測定，分別是Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2。人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd等是人參中人參皂苷的主要組成成分，具有不同的藥理活性。其中人參皂苷Rg1和Rd對中樞神經類疾病具有良好的療效[11-12]，人參皂苷Rb1和Rf在抗氧化、清除氧自由基、提高記憶力等方面有較強活性[13-14]，人參皂苷Rb2具有抗感染活性[15]；Re能降血糖、抗氧化等功能[14，16]，Rc能延長溶血發生的滯后時間[17]。稀有人參皂苷F2能夠引起乳腺腫瘤干細胞凋亡[18]，Rh2、Rg3則具有抗腫瘤等活性[19-21]，在腫瘤治療上表現出很高的應用價值，格外值得關注。

3.2 液相條件的選擇 試驗考察了無水甲醇-超純水、乙腈-超純水、濃度0.05%磷酸-乙腈等不同的梯度洗脫系統，發現乙腈-超純水系統和0.05%磷酸-乙腈梯度洗脫效果要明顯一些，而且由于乙腈黏度小，可以有效降低系統壓力，雖然利用0.05%磷酸作為流動相B時能得出很好的峰形，但與以超純水作為流動相B所出的峰形相差很小。所以，為了簡便的測定，最終選用乙腈-超純水系統梯度洗脫法進行分離。根據人參皂苷類成分最佳紫外吸收波長，設定HPLC體系的紫外吸收波長為203 nm。而在對柱溫的選擇是通過考察25、28和30 ℃時色譜峰的分離度，結果顯示30 ℃時色譜峰分離良好，故色譜柱溫選擇30 ℃。

選擇合適的梯度是分離人參單體皂苷的關鍵，而由于Rg1和Re極性相似，所以Rg1和Re很難分離。有文獻報道對它們進行分離試驗，但分離時間長且條件繁瑣，或是峰形不佳。如2008年版的《中國國家標準匯編》[7]是以高效液相色譜法測定生曬人參的人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1、Rc、Rb2含量，且標準含量檢出限除了人參皂苷Rf為25 mg/kg之外，其他人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rc、Rb2均為50 mg/kg。該方法測定的人參皂苷Rg1和Re保留時間太接近，相差只有0.239 min，而人參皂苷Rf與Rb1、Rb1與Rc保留時間分別相差0.296和0.23 min，不能很好的對這幾種皂苷單體進行分離。而且該標準只是測定了6種人參皂苷，還有其他重要的人參皂苷沒有進行測定。曹樹萍等[8]利用HPLC法測定了參麥注射液中9種人參皂苷的含量，但該方法測定得出的液相圖譜中各皂苷峰形不是很好，且Rg1和Re沒有完全分離開來。試驗色譜條件是在文獻的基礎上優化而成，在35～45 min，采用19%的乙腈梯度洗脫使人參皂苷Rg1和Re達到基本分離，所以試驗的梯度洗脫條件能達到對Rg1和Re的分離目的。

試驗對項目實驗室中人參培養須根及內生菌G22中10種皂苷成分進行了含量測定，其結果符合《中華人民共和國藥典》（2010年版）[2]中對Rg1、Re、Rb1含量測定的要求。研究表明人參皂苷試驗的精密度、重復性、穩定性、回收率試驗的范圍均符合相關標準。結果表明，在研究介紹的高效液相色譜條件下分離的人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2峰形良好，分離效果也比較理想。所以試驗探索的研究方法快準確簡便，穩定可靠，可以用來對人參藥材及內生菌的產物皂苷進行質量控制。

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