銀中楊黑星病病原菌鑒定

摘要 [目的] 對銀中楊黑星病病原菌進行鑒定。[方法]對黑龍江省哈爾濱市銀中楊上一葉部病害發病情況進行了田間調查和采集病害標本，并通過致病性測定、分子和形態學鑒定相結合。[結果]分離得到的菌株為山楊黑星孢菌，為銀中楊黑星病病原菌Fusichadium tremulae（Fr.）。[結論]此前尚未見山楊黑星病菌引起銀中楊黑星病的報道。

關鍵詞 黑星病；銀中楊；病原菌

中圖分類號 S763.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05451-02

Abstract [Objective] The aim was to study pathogen identification of Populus alba×berolinesis poplar scab. [Method] The field systematic investigation on popular leaf of Populus alba×berolinesis diseases in Harbin City， Heilongjiang Province was done combining the determination of pathogenic， molecular and morphological identification. [Result]The pathogen had been identified as Fusichadium tremulae（Fr.）. [Conclusion] The report on Populus alba×berolinesis poplar scab had not been seen.

Key words Poplar scad； Populus alba×berolinesis； Pathogen

銀中楊（Populus alba×berolinesis）是1961年黑龍江省森林與環境科學研究院以當地中東楊（P.berolinensis）為父本，采自熊岳銀白楊（P.alba）為母本，經人工雜交育種而成的新品種[1-2]。該品種具有生長速度快，材質優良，樹干筆直，樹姿優美，抗寒，抗病蟲害等優點，是三北地區防護林、速生豐產林和城鎮綠化主要優良品種之一[3]。楊樹黑星病是由山楊黑星孢F.tremulae（Fr.）引起的，該病菌主要危害合作楊（P. opera）、胡楊（P.euphratica）、小葉楊（P.simoni）、密葉楊（P.talassica）、苦楊（P.laurifolia）、柔毛楊（P.pilosa）等，可導致楊樹苗圃和幼林均能感染，連續數年發病，導致樹勢衰弱，輕者影響生長，重者整株枯死，嚴重制約了楊樹的生產發展[4-7]。筆者在黑龍江省哈爾濱市調查楊樹灰斑病時發現銀中楊的苗木、中幼林和大樹上有大面積的黑星病發生，危害較為嚴重，因此，對病原菌進行了鑒定，并對病害發生程度進行了初步調查。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料取自東北林業大學院內2年生銀中楊苗木病葉標本，研究標本現保存在東北林業大學森林保護學科森林病理實驗室。PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 ml。

1.2 病原菌分離、形態鑒定

采用單孢分離方法，在超凈工作臺內將病葉上的孢子粘在水瓊脂培養基上，然后在解剖鏡下用細玻璃針將單個孢子挑出，轉接在PDA培養基上，每個培養基挑3～5個，共5皿，在25 ℃恒溫箱中培養，獲得病葉上的致病菌。分離到的菌株編號為YH。形態鑒定方法：按照Ainswoth（1973）系統對病原菌進行鑒定[8]。

1.3 致病性測定

用分離得到的菌株YH菌絲塊接種，2年生銀中楊的健康葉片用75%乙醇表面消毒，將菌絲塊用鑷子搗碎，粘在葉子表面，然后噴無菌水用透光的塑料袋保濕48 h，后解除保濕，以無菌水處理為對照。觀察記錄發病情況。然后進行再分離，方法同“ 1.2 ”。

1.4 分子生物學鑒定

1.4.1 總DNA提取。采用賀偉等[9]的方法進行總DNA提取。

1.4.2 ITS區PCR擴增。

采用真菌通用引物ITS4進行擴增，PCR反應體系總體積為25 μl，反應液：BSA 2.5 μl；10倍PCR buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 5 μl，2.5 mmol/L dNTP 1.8 μl，5 U/μl Taq酶0.15 μl，模板DNA 3 ng，引物ITS4（由上海生工生物工程有限公司合成）各1 μl（25 μmol/L），加ddH2O總體積達12.05 μl，然后PCR儀上進行擴增。擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.5 病害危害情況調查

于2013-07～09月在黑龍江省哈爾濱市對銀中楊黑星病進行調查，了解銀中楊發病情況，所用病情分級標準見表1。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態學鑒定

病原菌菌絲體生于葉面組織表面，在病葉上表面呈黑霉狀或綿毛狀；在顯微鏡下觀察分生孢子梗褐色，無隔，單生或簇生，大多數直立，少數稍微彎曲。分生孢子橢圓形或長橢圓形，雙孢，少數三孢，（20.5～33.5）μm×（6.5～7.5）μm褐色。經鑒定YH為山楊黑星孢菌F.tremulae（Fr.）。未發現其有性型。

菌落特征：病原在PDA上菌落為黑色，菌落顏色隨著時間推移逐漸變白，20 d生長約7 cm，經鏡檢發現在PDA培養基上不產孢。

2.2 病原菌致病性

接種14 d后葉子上出現病斑，對照不發病。進行鏡檢，其形態特征與分離到的病原菌特征一致。證明所分離到的病原菌為銀中楊黑星病致病菌。

2.3 病原菌菌株YH的分子鑒定

經分子生物學輔助鑒定，YH擴增得到單一片段，但用水作為陰性對照的CK沒能得到該片段。通過對ITS區的測序，得到長度509 bp的rDNAITS基因序列（圖1），將得到的序列與GenBank中的序列進行同源性比較分析，結果表明，銀中楊黑星病病原與楊黑星菌（Venturia populina楊黑星病有性型[7]）同源性高達99%。

3 結論與討論

目前有關楊樹黑星病的相關報道有劉福德等（1995年）、莫延德（2002年發生在胡楊幼苗上）聶俊青等（2008年發生在青楊樹苗木上），病情發生報道均來自青海省[4-5，10]。該研究對黑龍江省哈爾濱市銀中楊黑星病大面積發生屬首次報道，綜合所得菌株的致病性測定、形態特征和分子生物學特性的結果，可以確定引起銀中楊葉部病害的病原菌為山楊黑星孢菌（F.tremulae），并對銀中楊發生情況進行了初步調查，為銀中楊黑星病后續研究奠定基礎。

參考文獻

[1] 郭阿君，王志英，鄒麗.銀中楊揮發性有機物釋放動態及其抑菌作用[J].東北林業大學學報，2011，39（12）：67-70.

[2] 呂偉強，丁宇，張樹軍，等.銀中楊楊樹葉化學成分研究[J].天然產物研究與開發，2013（25）：620-623.

[3] 任廣英，范竹珊，許成啟，等.銀中楊生長和生長規律[J].東北林業大學學報，2000，28（5）：67-71.

[4] 劉福德.楊樹黑星病的初步研究[J].森林病蟲通訊，1995（4）：8-9.

[5] 聶俊青，韓英，嚴作慶，等.青楊苗木黑星病的侵染規律及防治技術的研究[J].森林保護，2008（5）：33-36.

[6] 束慶龍，陳超燕，張歡，等.安徽楊樹病害種類及其危害特征研究[J].安徽農業科學，2005，33（7）：1193-1195.

[7] HOLESKI L M，VOGELZANG A，STANOSZ G，et al.Incidence of Venturia shoot blight in aspen （Populus tremuloides Michx.）varies with tree chemistry and genotype[J].Biochemical Systematics and Ecology，2009，37：139-145.

[8] 邵力平，沈瑞祥，張素軒，等.真菌分類學[M].北京：中國林業出版社，1984：297-339.

[9] 賀偉，任飛娟，郭利民，等.歐美楊潰瘍病的病原鑒定[J].林業科學，2009，45（6）：104-109.

[10] 莫延德.胡楊幼苗黑星病初步研究[J].陜西林業科技，2002（2）：54-55，64.