響應面法優化馬蹄皮渣中總黃酮的微波提取工藝研究

摘要 [目的]為更好地利用馬蹄加工皮渣中的資源，優化馬蹄皮渣中總黃酮的微波提取工藝，得到得率較高的黃酮類化合物。[方法]采用BoxBehnken中心組合響應面法優化馬蹄粉加工皮渣中總黃酮的微波提取工藝，建立了不同影響因素與馬蹄總黃酮得率之間的函數關系。[結果]確定最佳提取工藝條件為：乙醇濃度55.4%，料液比1∶ 30 g/ml，微波功率320 W，微波3 min，在此條件下重復提取2次，理論得率為2.376%，經過驗證得到總黃酮得率為2.365%，實測值與理論預測值之間的相對誤差為0.461%。[結論]研究結果表明，優化得到的提取工藝可靠，可為馬蹄加工廢棄物的綜合高效利用提供參考依據。

關鍵詞 馬蹄皮渣；總黃酮；響應面法；微波

中圖分類號 S645.3；TS209 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05634-04

Abstract [Objective] In order to take full advantage of processing byproduct of water chestnut， the ultrasonic extraction technology for flavone was optimized， high yield flavone compounds were obtained. [Method] The response surface design of BoxBehnken was used to optimize the ultrasonic extraction technology for flavone from waste residue of water chestnut starch， the functional relation was established between the factors and the total content of flavone. [Result] The optimum conditions for ultrasonic extraction were as follows： the ethanol concentration of 55.4%， the material and liquid of 1∶ 30 g/ml， the ultrasonic rate of 320 W， and the time of 3 min. The extraction process was repeated again. Theoretical value of total flavone is 2.376% in the optimal condition， and the final verification of total flavone is 2.365%. The relative error between the theoretical prediction and actual value is 0.461%. [Conclusion] The results showed that the optimized extraction process is reliable， which can provide reference basis for high effcient utilization of water chestnut waste.

Key words Water chestnut starch； Total flavone； Response surface methodology （RSM）； Ultrasound

馬蹄也稱荸薺，屬莎草科多年生淺水草本植物。馬蹄的地下球莖，不僅汁多味甜、營養豐富，而且具有一定的藥用價值，是優良的藥食兼用的果蔬類食品[1-4]。馬蹄在廣東已有較大面積種植，是廣東特色產業之一。目前除直接食用外，馬蹄還可被加工成淀粉、果脯和飲料等產品，其中以馬蹄粉產品居多，而馬蹄粉加工剩余的皮渣通常被丟棄，沒有得到充分利用。雖然近年來，馬蹄皮渣資源化利用研究已逐漸受到重視，但其研究主要集中于馬蹄皮渣成分分析，工業化利用馬蹄皮渣的研究報道較少[5-6]。

馬蹄皮渣中含有豐富的黃酮類化合物，而黃酮類化合物的生理活性作用較為廣泛，具有生物抗氧化性、抗衰老、治療心腦血管疾病、抑菌、清除自由基、降血脂、降血壓等藥用保健功能[7-9]。馬蹄皮渣提取黃酮類化合物可作為其高值利用的重要途徑[10-11]。筆者以馬蹄皮渣為原料，采用微波輔助提取技術對馬蹄皮渣總黃酮的提取工藝進行響應面設計，優化各因素技術參數，以期得到得率較高的黃酮類化合物，為高效開發利用馬蹄皮渣資源提供參考和指導。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬蹄皮渣為廣州市泮塘食品有限公司馬蹄粉加工后剩余皮渣，50 ℃烘干24 h后粉碎至80目。主要試劑：蘆丁為生化試劑；亞硝酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁均為分析純。主要儀器：LG 102.4A離心機；WD 800型微波爐；RE52A旋轉蒸發器；U3010 Spectrophotometer 紫外可見分光光度儀；DWF100型電動植物粉碎機。

1.2 方法

1.2.1

馬蹄皮渣總黃酮的測定。以蘆丁為對照品，采用絡合-分光光度法測定馬蹄皮渣中總黃酮得率[12]。

1.2.1.1

配制蘆丁標準液。準確稱取120 ℃干燥至恒重的標準品10.0 mg，用體積比30%的乙醇液溶解，用100 ml容量瓶定容，制得蘆丁的標準液。

1.2.1.2

確定檢測波長。分別取5 ml蘆丁標準液和馬蹄皮渣總黃酮提取液于10 ml容量瓶，加入NaNO2-Al（NO3）3-NaOH絡合試劑，放置15 min，利用紫外可見分光光度儀在400～700 nm波長范圍內掃描，考察兩者在哪一個波長同時具有強烈吸收，以此來確定檢測波長[12]。

1.2.1.3

繪制標準曲線。準確吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml的蘆丁標準液，分別置于10 ml容量瓶，補充30%乙醇至5 ml，然后先加5%亞硝酸鈉溶液0.3 ml，搖勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液0.3 ml，搖勻，再放置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液4.0 ml，用30%乙醇定容至刻度，在波長510 nm處測吸光度。以吸光度A為橫坐標，蘆丁濃度C為縱坐標，得到標準曲線方程：C=0.083 1A-0.000 07，相關系數r=0.998 1，在蘆丁濃度為0～0.05 mg/ml范圍內呈良好的線性關系[12]。

1.2.1.4

測定馬蹄皮渣總黃酮。準確吸取2份1.0 ml馬蹄皮渣總黃酮提取液于10 ml容量瓶中，一份不加顯色劑，另一份加NaNO2-Al（NO3）3-NaOH絡合試劑顯色，均用30%乙醇定容。靜置15 min后，以未加顯色劑的提取液為參比溶液，加入顯色劑的提取液為樣液，在波長510 nm處測定吸光度，利用標準曲線方程計算提取液的總黃酮得率[9，12]。

1.2.2

馬蹄皮渣總黃酮的提取。

準確稱取2.0 g馬蹄皮渣原料，置于150 ml錐形瓶中，根據文獻方法[9]進行提取，先進行乙醇濃度、微波時間、料液比、微波功率對馬蹄皮渣總黃酮得率影響的單因素試驗，根據單因素試驗結果進行響應面優化試驗，最終獲得馬蹄皮渣總黃酮的優化提取工藝。馬蹄皮渣總黃酮得率根據按“ 1.2.1.4 ”中的方法測定。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對提取效果的影響

將6份馬蹄皮渣原料（2.0 g/份），置于150 ml錐形瓶中，固定料液比為1∶ 20 g/ml、微波時間為2.5 min、微波功率為320 W，分別加入15%、30%、45%、60%、75%和90%的6種不同濃度乙醇溶液。測定提取液的吸光度，比較不同乙醇濃度對馬蹄皮渣總黃酮得率的影響。

由圖1可知，起初隨乙醇濃度增加，黃酮類化合物溶解度顯著增加（P<0.05），在微波場中，乙醇對基體細胞膜的破壞作用要強于水，從而導致更多的總黃酮溶出。但當乙醇濃度大于60%時，黃酮類化合物溶解度則隨乙醇濃度的增加而逐漸下降。在高醇濃度情況下，一些醇溶性雜質、色素等成分溶出量增加，并與黃酮化合物競爭同乙醇-水分子結合，以致黃酮類物質的得率下降。另外，由于微波爐是個封閉體系，高純度的乙醇沸點較低，易揮發，使得爐內快速產生有大量的乙醇氣體，存在安全隱患。因此，以不高于60%的乙醇作為研究的上限。

2.2 料液比對提取效果的影響

稱取7份粉末樣品（2.0 g/份），置于錐形瓶中，固定微波時間為2.5 min、微波功率為320 W，按照料液比1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30、1∶ 35、1∶ 40 g/ml分別加入60%的乙醇溶液。測定樣品的吸光度，研究不同料液比對總黃酮得率的影響。

由圖2可知，總黃酮得率隨著提取液量的增加而逐漸增大，當料液比達到1∶ 25 g/ml后，提取的總黃酮含量進入平臺期，繼續增加溶劑用量得率幾乎沒有變化。這是因為溶劑比例的提高加大了溶劑與原料之間總黃酮成分的濃度差，促使原料內部的總黃酮溶出，減少原料內部總黃酮 的殘留量，因而提高馬蹄皮渣總黃酮得率。隨著溶劑比例增大，總黃酮得率增加，但當料液比達到1∶ 25 g/ml后，因馬蹄皮渣中總黃酮已基本提取完全，總黃酮得率趨向穩定，受溶劑比例增加影響不大。在馬蹄皮渣總黃酮得率較高情況下，為減少提取成本，以1∶ 20、1∶ 25和1∶ 30 g/ml作響應面分析法的料液比因素水平。

2.3 微波時間對提取效果的影響

稱取8份粉末樣品（2.0 g/份），置于錐形瓶中，固定乙醇濃度60%、料液比1∶ 25 g/ml、微波功率320 W，按照0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min分別進行微波提取。測定提取液的吸光度，比較微波提取時間變化對馬蹄皮渣總黃酮得率的影響。

由圖3可知，馬蹄皮渣總黃酮得率隨微波提取時間增加先增大后減小，當微波提取3.0 min時得率最大。這是因為當微波提取時間增加時，馬蹄皮渣中總黃酮成分及提取溶劑熱運動加劇，局部產生極大的熱量，導致溫度急劇非均勻升高，迅速達到沸點以上，造成內部體積急劇膨脹，在極短時間內使得馬蹄皮渣總黃酮所在基體細胞膜破裂，總黃酮成分不斷進入溶劑。當微波提取時間過長時，提取環境溫度過高，黃酮類物質中某些不耐熱的成分分解破壞，提取溶劑揮發損耗，導致總黃酮得率降低。

2.4 微波功率對提取效果的影響

稱取5份粉末樣品（2.0 g/份），置于錐形瓶中，固定料液比1∶ 25 g/ml、乙醇濃度60%，按照160、320、480、640、800 W微波功率條件微波提取3 min，比較微波功率變化對馬蹄皮渣總黃酮得率的影響。

由圖4可知，馬蹄皮渣總黃酮得率隨微波功率增加先增大后減小，當微波功率為320 W時得率最大。這是因為微波功率增加時，料液擴散速度加快，并且功率越高，對馬蹄皮渣細胞的破壞性越大，越有利于馬蹄皮渣中黃酮類化合物的浸出。但微波功率過高時，提取溫度發生較大波動，產生瞬間高溫使熱不穩定黃酮類化合物分解或部分分解，提取溶劑揮發較快，反而降低馬蹄皮渣總黃酮得率。因此，以160、320和480 W作響應面分析法的微波功率因素水平。

以上水平是測出的最佳方案，其預測值為2.380%。但是由于試驗條件的限制，按乙醇濃度為58.8%，料液比1∶ 30 g/ml，微波功率320 W進行試驗，其預測值為2.379%。為了節約成本該試驗選取乙醇濃度55.4%，料液比1∶ 30 g/ml，微波功率320 W，其預測值為2.376%，為該試驗條件下最優水平組合。按此最優水平組合工藝驗證試驗（其他條件與RSM優化試驗一致），重復3次，測得實際總黃酮平均得率為2.365%，RSM的理論預測值為2.376%，實測值與理論預測值之間的相對誤差為0.461%，說明采用RSM法優化得到的最佳總黃酮得率的提取工藝參數可靠，具有實用價值。

3 結論

以馬蹄皮渣總黃酮提取得率為指標，在單因素試驗基礎上，根據BoxBehnken的中心組合試驗設計原理，運用Design Expert 7.1.3軟件進行編程計算，采用3因素3水平的響應面分析法優化微波提取馬蹄皮渣總黃酮的工藝，得到馬蹄皮渣總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度為55.4%，料液比1∶ 30 g/ml，微波功率320 W，微波3 min，同條件提取2次，在此條件下總黃酮得率為2.365%。與傳統的浸提法相比，微波輔助萃取 植物有效成分，是利用不同結構物質在微波場中吸收微波能力的差異，使機體物質中某些區域或萃取體系中某些成分選擇性加熱，從而使被萃取物質從基體或體系中分離，是一種新型現代提取技術，具有保護活性成分、時間短、速度快、萃取率高、安全節能等優點，具有良好的應用前景[9]。

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