利用蠶豆根尖細胞微核技術對新疆伊犁河水質檢測

摘要 [目的]研究新疆伊犁河水域的不同位點的水質污染程度。[方法]利用蠶豆根尖微核技術對新疆伊犁河水域的30個水樣進行動態(tài)監(jiān)測和評價。[結果]各樣點 MCN ‰和對照組相比差異極顯著（P<0.01），30個水樣點中有12個水樣點無污染（PI值在 0～1.5）；10個水樣點輕度污染（PI值在1.5～2.0）；8個水樣點中度以上污染（PI值2.0以上）。[結論]新疆伊犁河水質受到不同程度的污染，部分區(qū)域中度以上污染，應及時加以治理。

關鍵詞 蠶豆根尖；微核技術；污染指數(shù)；伊犁河

中圖分類號 S643.6 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05369-03

Abstract [Objective] The study aimed to evaluate the water quality of the Yili River in Xinjiang Province. [Method] The micronucleus test of Vicia faba root tip cell were adopted to dynamic monitor and evaluation of 30 water sample that collected from different site of Yili River. [Result] Compared with the control group， the MCN‰ of the samples showed extremely significant difference （P<0.01）； the result showed that， among the 30 sampling area， 12 of them determined as non pollution （PI value was in 0-1.5）， 10 of them were belonging to light pollution （PI value was in 1.5-2） and the other 8 area was determined as above moderate pollution （PI value was above 2.0）. [Conclusion] From the result we can find out that some area of the Yili River in Xinjiang Province were polluted in moderate level， although the polluted level of each area were different； in this regard， it must be necessary to take or improve some control method to keep it clean.

Key words Vicia faba root tip； Micronucleus technique； Pollution index； Yili River

隨著城市工業(yè)化的發(fā)展，城市污水量在逐年增加，污水成分日趨復雜，污水中含有大量的病原體、致癌原以及對人有急慢性毒作用的化學物質和放射性物質[1]。在多種監(jiān)測方法中，生物學方法的優(yōu)越性就在于能直接監(jiān)測污染物對生物危害程度的生物效應。所謂微核是指由于生物受到內外環(huán)境因素的影響，染色體的結構發(fā)生異常變化，形成無著絲粒斷片或染色體在后期時移動滯后，在細胞分裂后期，無著絲粒斷片或滯后染色體不能向細胞的兩極運動，而是殘留在細胞中央的赤道板附近，當子代細胞形成時，游離于細胞漿中形成微核[2]。微核技術（micronuleus test， MCNT）是監(jiān)測環(huán)境污染物對遺傳物質DNA損傷的一種新的生物學檢測系統(tǒng)，是根據(jù)在細胞質內產(chǎn)生額外核小體的現(xiàn)象來判斷理化因素誘導染色體異常作用的一種簡單的體內試驗方法[3]。利用蠶豆根尖微核技術自1982年建立以來，在環(huán)境誘變和致癌因子的檢測研究，特別是在水質污染和致突變劑檢測研究中得到了廣泛應用，并被許多西方國家刊為規(guī)范監(jiān)測方法，我國也將這一技術引入《環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范》中，用于水環(huán)境監(jiān)測[4]。蠶豆的染色體組型為6對，染色體大，而且根尖中含有較多的分裂細胞，因此非常適合顯微觀察[5]。

新疆伊犁河是亞洲中部的一條又是中國和哈薩克斯坦的國際河流，位于東經(jīng)74°～85°、北緯 42°～47°，河流由東南流向西北，全長1 500 km，流域面積約 57 萬km2，其水量居新疆眾河之首。在中國伊寧附近河谷寬展，平原廣闊，土壤肥沃，農、畜牧業(yè)發(fā)達。但隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展，河水環(huán)境質量日趨下降，針對伊犁河富營養(yǎng)化和水質狀況的調查與研究開展較多，但有關致突變性污染狀況的研究鮮有報道。伊犁河不僅是重要漁業(yè)基地，又是重點風景區(qū)，顯然加強這方面研究對保障伊犁河流域人民衛(wèi)生健康，建立完善的水質管理措施，指導伊犁河環(huán)境整治有比較重要的意義。蠶豆根尖細胞微核試驗是我國水環(huán)境監(jiān)測的規(guī)范化方法之一，筆者利用該技術評價伊犁河水質污染狀況，以期為綜合評價水質狀況提供參考，并為建立伊犁河生態(tài)監(jiān)測機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。30瓶新疆伊犁河水樣，于不同時間采自疆伊犁河。新疆蠶豆（Vicia faba），選用蠶豆種子的原因是其生命力較強，在污水中能較好的存活，而且產(chǎn)生微核的靈敏度和穩(wěn)定性較高，其生理活性可直觀地反映污水對植物細胞的影響。

1.1.2 主要儀器。生化培養(yǎng)箱，購自上海申賢恒溫設備廠；顯微鏡和顯微照相系統(tǒng)，均購自深圳市西派克光學儀器有限公司；恒溫水浴鍋，購自上海比朗儀器有限公司；血球分類計數(shù)器，購自江陰市文林醫(yī)療器械五金廠。

1.1.3 主要試劑。卡諾氏固定液（甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1）、70%乙醇、無水乙醇、堿性品紅、5 mol/L鹽酸等均為國產(chǎn)分析純，市售；蒸餾水，實驗室自制。

1.2 方法

1.2.1 采樣點的布設和水樣采樣。為了對新疆伊犁河水的不同點進行分析，真實反應伊犁河水質情況，依采樣的科學性和采樣要求，于2013年3月對伊犁河兩岸共選擇了30個采樣位點進行采樣，每2個采樣點平均距離為1 000 m（見圖1）。每個采樣點取水的原則為：采水處離河堤離1 m左右，1個采樣地點取3個水樣，每個水樣150 ml，并把這3個水樣混勻裝于500 ml的潔凈的礦泉水空瓶內用記號筆標號，并于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蠶豆根尖細胞微核試驗[5]。①浸種，催芽。選擇顆粒飽滿、大小均勻的蠶豆種子，用蒸餾水清洗2～3次后分別放在裝有各種水樣的平板中，放在（25±1）℃的恒溫箱中培養(yǎng)1～2 d。陰性對照組蠶豆始終采用自來水培養(yǎng)；陽性對照組則先用自來水培養(yǎng)72 h后用0.01%的 HgCl2浸泡 1 h，沖洗干凈后恢復自來水培養(yǎng)；試驗組蠶豆先在自來水中浸泡24 h后用新疆伊犁河各水樣進行分組培養(yǎng)。②根尖固定。幼根長1.5～2.0 cm后，用刀片切取根尖1.0 cm，用新配的卡諾氏固定液（甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1）固定24 h，再用95%的酒精清洗后，轉入70%的酒精中保存待用。③材料解離。用1 mol/L HCl解離根尖15 min，在60 ℃的水浴中繼續(xù)解離 8～10 min。④制片。用堿性品紅染色20 min，用自來水沖洗，然后采用壓片法制片。⑤常規(guī)鏡檢：每個待測水樣及對照組隨機檢查3個根尖，每個根尖在高倍鏡下至少觀察1 000個生長點的細胞，并記錄發(fā)生微核的細胞數(shù)，并將測得的試驗組與對照組的微核率分別進行比較。微核的著色相同。轉動微調時，與主核同一個水平面上；圓形或卵圓形，界限清楚，包含于胞漿中，直徑小于主核直徑的 1/3，并與主核不相連；微核完整，不重疊，但死亡或降解的細胞除外。必要時，可用相差顯微鏡幫助鑒別。

1.2.3 微核識別的標準。目前多數(shù)學者認為，在鏡檢細胞微核是應按下列標準計數(shù)微核[6]：①凡是主核大小 1/3 以下并與主核分離的的小體；②小核的著色與主核相當或稍淺；③小核形態(tài)可為圓形、卵圓形或不規(guī)則形，界限清楚，包含于胞漿中。

1.2.4 各測試樣品（包括對照組）微核千分率（MN）‰計算。根據(jù)下列公式計算。

1.2.5 根據(jù)污染指數(shù)判斷水質。此方法可避免因試驗條件等因素帶來的MN‰的波動，故較宜適用。污染指數(shù)在0～1.5區(qū)間為基本無污染，1.5～2.0區(qū)間為輕度污染；2.0～3.5區(qū)間為中度污染，3.5以上為嚴重污染。

3 結論與討論

通過對新疆伊犁河各采樣點與對照組的 MCN‰ 進行污染指數(shù)分析，得知伊犁河水質受到不同程度的污染。不同水樣采集點的污染程度與其所處的地理環(huán)境和所受到人類活動的影響有關，例如：1、2、3、4、13、14、15、16、17、18、19及 28號水樣點的污染水平為無污染，這些取樣點都在伊犁河河流比較急，離人類生產(chǎn)活動較遠的地方；5、6、10、12、20、22、23、27、29及 30號水樣點的污染水平為輕度污染，這些樣點在伊犁河兩側離村莊較近的偏遠地區(qū)；9、11、21、24及 25號水樣點為中度污染，這些水樣點主要在伊犁河2個大橋中間以及公園附近采樣；7、8及 26號水樣點為重度污染，這可能是因為周邊食堂和工廠的生活污水和大量廢水的不合理排放所致。

新疆伊犁河是亞洲中部的一條國際河流，不僅是漁業(yè)基地，又是重點風景區(qū)。該研究利用蠶豆根尖微核技術初步研究伊犁河水質污染狀況，不僅為伊犁河水質補充更全面的參考數(shù)據(jù)，為綜合評價水質狀況提供參考，而且會起到當?shù)赜嘘P部門的重視，對污染區(qū)進行及時加以治理。尤其在研究位點的 7、8和26號位點為伊犁河大橋兩側食堂和游樂場區(qū)，游客們聚集較多，相應部門應治理生活污水排放及指定良好的制度制止游客在旅游中途亂扔垃圾等不良習慣，為今后的伊犁河兩岸居民的人體健康，環(huán)境優(yōu)美提出貢獻。

目前，在化學物質致突變性檢測方面的成熟方法有很多，新方法也層出不窮，但應用于環(huán)境污染或環(huán)境流行病學 調查的大范圍、大樣本的遺傳毒性檢測，卻仍然是為數(shù)不多的幾種經(jīng)典方法，如利用人淋巴細胞和小鼠骨髓紅細胞進行的藥物檢測和各種微核試驗。微核技術具有操作簡單、快速、 靈 敏、方便、經(jīng)濟等特點[7]，而且綜合性強，同時還具有化學監(jiān)測和物理監(jiān)測所不能達到的效果，更接近于污染物對生物和人類的危害情況，植物的微核檢驗應用面廣，取材方便，是一種行之有效的方法。蠶豆根尖微核試驗作為其中之一，具有許多其他測試手段無法比擬的優(yōu)點：第1，此方法可靠性和靈敏性較高，因蠶豆具有染色體條數(shù)少、個體大、便于統(tǒng)計、具有栽培面廣、染色制片易于觀察等特征而取材方便，是一種行之有效的方法；第2，蠶豆根尖微核試驗的成本較低，這對于一種致突變性檢測方法是十分重要的；第3，其檢測物譜較廣；第4，在方法學上，其也特別適合環(huán)境致突變性監(jiān)測和腫瘤流行病學調查。該方法試驗材料容易獲得，儀器設備簡單，也不損害工作人員的健康；與其他植物測試法相比，其還具有個體差異小及不受地理、氣候條件限制等優(yōu)點[8]。但是，蠶豆根尖微核試驗也存在一些不足之處。首先，其畢竟不是動物細胞試驗，缺乏一定的代謝活化系統(tǒng)；其次，無法根據(jù)結果直接指示受試樣品中致突變物的類型和誘變機制；而且，微核的判定、計數(shù)容易帶有一定的主觀性。盡管蠶豆根尖微核試驗與目前一些其他細胞或分子生物學檢測方法相比有某些方面的不足，但由于該方法的簡便、快速及其經(jīng)濟性，在環(huán)境監(jiān)測、污染調查中作為

致突變性大范圍篩選還是十分有價值的[9]。雖然這是

一個已經(jīng)成熟的方法，但是并沒有過時，與其他化學或生物測試方法聯(lián)合使用，還將進一步擴大它的應用前景。

水系處于一個動態(tài)變化過程，因此水樣的分析應該在不同時期多次，多層面地進行，該試驗結果只說明了 2013 年春季新疆伊犁河水的水質情況，如果要全面分析，還有待于進一步充實數(shù)據(jù)，得出更加全面的結論，為水體環(huán)境的保護提供準確的數(shù)據(jù)。

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