成都平原主養草魚·搭配鯽魚池塘底泥中的細菌群落結構分析

摘要 [目的]分析成都平原主養草魚、搭配鯽魚池塘底泥中的細菌群落結構。[方法] 通過構建細菌16S rRNA基因克隆文庫，對陽性克隆子進行多樣性分析和構建系統發育樹。[結果] 依據97%序列相似性劃分OUT，所構建的文庫共獲得171個克隆子，并劃分為14個OTUs（操作分類單元），其多樣性指數Shannon（H）和優勢度指數Simpson（D）分別為2.12和7.15，豐富度指數SChao1和SACE均為16。池塘底泥中主要的細菌類群為：梭桿菌門（24%）、變形菌門（55%）、浮霉菌門（10.5%）、綠彎菌門（5.9%）、擬桿菌門（2.3%）、放線菌門（1.8%）和厚壁菌門（0.6%）。 [結論]Cetobacterium 、Prolixibacter、Rhodocyclus、Candidate、Planctomycetacia、Thiocapsa、Desulfomicrobium和Sterolibacterium等屬菌在脫氮除磷、降低硫化物、降解有機質等發揮重要作用。池塘底泥既是水生態系統修復功能菌的資源庫，但也存在著Xanthomonas等致病性和功能未知的細菌庫。

關鍵詞 草魚、鯽魚；池塘底泥；16S rRNA；細菌多樣性

中圖分類號 S965.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05477-04

Abstract [Objective] The paper was to investigate bacterial community structure in Chengdu fishfarm sediment stocked with dominated Grass Carp and subordinate Crucian. [Method] Through the construction of 16S rRNA cloning library of bacteria， the positive clone was carried out community diversity analysis， and the phylogenetic tree was constructed. [Result] OUT （Operational Taxonomic Units） was classified according to sequences similarity of 97%， all 171

clones were clustered into 13 OTUs. The richness index Schao1 and SACE were 16 and 16， and the dominancy index （D） and diversity index （H） were 2.12 and 7.15， respectively. All sequences were respectively fell into the phylum of Fusobacteria （24%）， Proteobacteria （55%）， Planctomycetes （10.5%）， Chloroflexi （5.9%）， Bacteroidetes （2.3%）， Actinobacteria （1.8%） and Firmicutes （0.6%）. [Conclusion] The members of Cetobacterium， Prolixibacter， Rhodocyclus， Candidate， Planctomycetacia， Thiocapsa， Desulfomicrobium and Sterolibacterium play a key role in denitrogenation， phosphorus and sulfate reducing and organics degradation， while the Xanthomonas was an plant pathogen， this result suggested that the sediment was not only a bacterial source for ecological restoration， but also a reservoir for pathogenicity.

Key words Grass Carp and Crucian； Fishfarm sediment； 16S rRNA； Bacterial diversity

混養是指在同一個魚塘混合養殖多種魚類。混養是提高池塘養魚產量的重要措施，也是目前我國池塘養魚的技術特色，目前已獲得了大面積推廣與應用。混養具有以下優點：①可以充分利用池塘各個水層，發揮水體生產潛力；②全面合理利用池塘天然餌料資源，提高餌料利用率；③發揮養殖魚類之間的共生互利關系，改善池塘生態環境；④降低養殖成本，增加經濟收入[1]。然而，由于淡水養殖池塘是半靜態、相對封閉的小型水體，自凈能力較弱[2]。投餌施肥、生物排泄與死亡殘骸的長期積累使得高密度的混養養殖模式水體中有機質含量超高[3]，致使自身的環境狀況發生惡化，降低水體的利用效率，也使健康養殖存在一定的風險，甚至當養殖結束后養殖廢水的排放會影響周圍的生態環境。長期以來，許多學者對養殖系統中水質狀況以及營養收支平衡進行了研究，以期達到養殖上以最小投入換來最大收益的目的，并提出通過改善餌料的加工及投喂方式來降低水質的污染速率，但該方法存在成本高、易引起二次污染等缺點。因此，為了提高水產養殖質量和效益，對人工養殖池塘生態系統尤其是池塘底泥微生物的研究已成為未來水產養殖行業的研究熱點。

底泥微生物群落作為水產養殖生態系統的重要組成部分，在能量流動、物質循環、水質環境、疾病控制和污水管理等方面發揮著重要的作用[4]，此外也是評價養殖環境狀況的重要生物檢測指標[5]。因此，對人工養殖系統底泥微生物的研究越來越受到水產行業及科研人員的重視。程瑩寅[4]、馬英[6]等分別采用16S rRNA文庫構建方法對主養草魚池塘底泥微生物群落多樣性、對蝦養殖池沉積物細菌的遺傳多樣性進行研究。蔡瑩[7]等在傳統培養方法的基礎上對蝦池沉積物細菌的對太湖沉積物可培養方式進行改進并采用DGGE技術分析了蝦池沉積物細菌的多樣性。以上研究發現池塘底泥中微生物種類及功能的復雜性，從池塘養殖系統來看，水體中微生物不僅包含有益菌，而且包含致病性微生物。在池塘底泥微生物利用方面，范立民[8]從吉富羅非魚養殖池塘底泥中分離出具有反硝化功能細菌脫氮硫桿菌。林亮[9]研究了芽孢桿菌對蝦池底泥細菌群落的影響，發現芽孢桿菌制劑能夠改善池塘底泥細菌類群的組成，提高對蝦的成活率、體重和產量的提高。以上研究有助于了解池塘底泥微生物在水體凈化過程中作用，開發利用微生物新資源。基于此，筆者利用16S rRNA免培養法分析成都新津主養草魚、混搭鯽魚的混養模式池塘底泥中細菌多樣性及群落構成。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2013年7月中旬，使用重力式采泥器分別在四川省成都市新津縣五津魚養殖場采集主養草魚、搭配鯽魚池塘底部四角及中心部位采集底泥樣品，采集后樣品迅速密封，并置于干冰中運輸至實驗室，凍存于-80 ℃下保存備用。

1.2 底泥樣品總DNA提取及16S rRNA基因PCR擴增

分別稱取10 g池塘四角及中心部位底泥于無菌離心管中，置于漩渦混合器上振蕩混勻，稱取0.5 g混勻的底泥樣品，用E.Z.N.A. Soil DNA Kit （Omega， 美國）提取總DNA，具體方法參見試劑盒說明書。DNA抽提重復3次并混勻，以減少DNA在提取過程中產生的偏差。16S rRNA基因的PCR擴增條件及程序參考XIANG等描述方法[10]，將擴增產物用1.0%瓊脂糖電泳進行檢測，-20 ℃下保存。

1.3 16S rRNA 基因文庫的構建

PCR產物經（純化試劑盒）純化后，依據pGEMT Easy Vector SystemⅠ（美國Promega 公司）說明書將PCR產物連接至pGEMT載體，并將重組質粒轉化至感受態大腸桿菌E.coli JM109中，涂布于含氨芐青霉素、Xgal和IPTG的LB 平板上，篩選陽性克隆子。

1.4 16S rDNA測序和系統發育分析

挑選陽性克隆子，用Plasmid Mini Kit Ⅰ（美國Omega Inc）提取重組質粒，采用菌落PCR方法檢測目的片段是否正確插入，挑選含有正確插入片段的重組質粒送交上海華津生物科技有限公司測序。所獲得的序列用CLASSIFIER （RDP II， http：//rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp）進行分類，并提交至GenBank數據庫中與已有序列經Blast進行同源性檢索后，從相同序列中選取代表序列與數據庫中典型菌株序列一起使用MEGA5.0軟件中的Neighborjoining法進行1 000次步長計算構建系統發育樹[11]。

2.2 16S rRNA基因克隆文庫多樣性分析

所構建的克隆文庫共獲得171個有效克隆序列，經BioEdit軟件分析后共得到13個不同分類操作單元（OTUs）。多樣性分析結果表明，該16S rRNA基因文庫的最大OTU豐富度指數SChao1和SACE均為16，多樣性指數（H）和優勢度指數（D）分別為2.12和7.15，文庫覆蓋率為81.2%，可知該文庫體現了池塘底泥中大部分的細菌菌群的多樣性。從圖2可以看出，曲線上升幅度逐漸平緩，OTU個數增加的幅度隨著克隆子個數的增加而逐漸減小，表明文庫基本趨近飽和，文庫能覆蓋樣品中大部分的菌系，能夠真實反映樣品中細菌的多樣性。因此，構建的16S rRNA克隆文庫能夠較好反映池塘底泥中細菌菌群結構。

3 討論

底泥細菌作為水產養殖生態系統的重要組成部分，不僅參與養殖系統中有機質、無機鹽等物質循環代謝及能量代謝，也影響養殖動物消化系統微生物菌群結構，因而與養殖動物的健康狀況及水質保持密切相關。為探明成都平原主養草魚、搭配鯽魚養殖池塘底泥中細菌群落多樣性及結構，筆者通過構建16S rRNA基因文庫分析了成都新津主養草魚、混搭鯽魚的混養模式池塘底泥中細菌多樣性及群落構成，并采用多樣性指數H、優勢度指數D、覆蓋度C及稀釋度曲線等對所建立的文庫進行評估。結果表明，該16S rRNA基因文庫多樣性指數H和優勢度指數D分別為2.12和7.15，文庫覆蓋率為81.2%，稀釋度曲線減趨平緩，說明該研究方法及研究結果不僅展示出池塘底泥中細菌菌群的豐富多樣，同時也能夠體現池塘底泥菌群的結構類型和組織水平。

程瑩寅[4]等研究發現主養草魚池塘底泥中主要的細菌類群歸屬于7個細菌門類：變形菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、放線菌門和浮霉菌門。該研究中主養草魚、混搭鯽魚的混養模式池塘底泥中細菌也包含了以上幾個類群，在大的分類上和程瑩寅等研究相同，但數量上差異較大，該研究中細菌的優勢類群是變形菌門（55%）和梭桿菌門（24%），且變形菌門占有絕對的數量優勢，盡管梭桿菌門在以前的報道中曾出現過，但很少作為主要優勢類群。通過系統發育分析發現，池塘底泥中Cetobacterium屬、Xanthomonas 屬和Sulfuritalea屬是其中的優勢菌，所占比例為56.2%，目前還未見到池塘底泥中有這些屬的報道。NI Jiajia等[13]曾在淡水魚的消化道中分離到Cetobacterium somerae，能夠產生唯一含礦物質的維生素B12調節魚類新陳代謝，該菌存在于魚類消化道可能是與池塘底泥中細菌相互影響的結果。黃單胞菌屬（Xanthomonas）[14]是專門寄生在植物上的，也可以是腐生的，能夠引發多種植物病害，目前雖尚未有對動物尤其是魚類危害的報道，但對養殖系統中水生植物存在著潛在威脅，同時該菌所產生的黃原膠卻可以廣泛應用于食品、石油等工業。Hisaya Kojima[15]等曾在淡水湖中分離到Sulfuritalea屬，該菌是一種兼性自型微生物，營養結構較簡單。

除以上優勢菌外，筆者還分離得到Sterolibacterium、Caldilinea aerophila、Streptomyces aomiensis、Thermolithobacter ferrireducens、Prolixibacter、Planctomycetacia、Thiocapsa、Desulfomicrobium、Rhodocyclus和 Alkalitalea屬細菌，其中Prolixibacter屬菌具有較好的NaCl耐受性，對營養物質要求比較低，同時還具有較強的降解BTEX類污染物的能力[16]，能夠有效減少池塘受BTEX類化合物的污染。在水產養殖過程中，大量殘餌、養殖生物排泄物等沉到水底增加了底部有機物的含量，從而一方面造成水體中N、P元素的升高，在很大程度上加重了水體富營養化，甚至造成水產養殖對于環境的污染；另一方面，也增加了硫化物的含量，硫化物對魚類生長危害較為嚴重，能夠降低機體中血液的攜氧能力，刺激、腐蝕魚類的鰓組織。研究表明Sterolibacterium denitrificans是一種膽固醇降解菌，能夠降解養殖動物死后固醇類物質的代謝；Rhodocyclus、Candidate和Planctomycetacia屬的菌群具有脫氮除磷的功能；Thiocapsa、Desulfomicrobium屬菌大多為厭氧菌，常存在于廢水池、含硫溫泉及湖泊等淡水環境中，具有降低水中硫化物的作用。因此它們在養殖水體生態環境修復、改善水質、提高水產養殖質量方面發揮著重要作用。其他屬細菌也在參與水體中物質代謝，能量流動及微生物間相互作用發揮作用，例如Alkalitalea等具有纖維素降解功能等。

綜上所述，成都平原主養草魚、搭配鯽魚池塘底泥中細菌種類很豐富，這些豐富的細菌可能執行著很復雜的功能，

為水生態系統中物質循環與能量流動做出了重大貢獻。同時，池塘底泥中也存在許多潛在的致病性和未知的細菌，池塘底泥微生物對養殖魚類的影響及機理值得進一步研究。

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