大腸桿菌產β內酰胺酶發酵條件研究

摘要 [目的]優化大腸桿菌（Escherichia coli）產β內酰胺酶發酵條件。[方法]選用大腸桿菌為供試菌株獲得β內酰胺酶，通過對該菌種發酵條件進行優化，提高β內酰胺酶活力。[結果]確定大腸桿菌產β內酰胺酶的最佳發酵條件為：溫度37 ℃、初始pH 7.8、接種量2.0%、裝液量65 ml/250ml發酵瓶。使用最佳發酵條件對大腸桿菌進行培養，最終得到的β內酰胺酶活力為178.54 U/ml，比優化前提高了33%。[結論]研究可為分離純化β內酰胺酶及其降解產物提供一定的參考依據。

關鍵詞 β內酰胺酶；大腸桿菌；發酵；優化

中圖分類號 S188+.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05642-03

Abstract [Objective] To optimize fermentation conditions of βlactamase produced by Escherichia coli. [Method] E. coli was selected as tested bacteria to obtain βlactamase， through optimization of the fermentation conditions， the activity of βlactamase was improved. [Result] The optimum fermentation conditions were： 37 ℃ fermentation temputure， pH 7.8， 2.0% inoculum volum， 170 r/min rotation speed， 65 ml/250 ml medium volume. The final yield of βlactamase activity is 178.54 U/ml， which is increased to 33% in comparison with that of the initial training. [Conclusion] The study can provide a certain reference basis for isolation and purification of βlactamase and its degradable products.

Key words βlactamase； Escherichia coli； Fermentation； Optimization

β內酰胺酶最早是1940年在大腸埃希氏菌中被確定[1]，在《中國藥學詞典》中定義為：能裂解青霉素和頭孢菌素類抗生素的β內酰胺環，使它們滅活的水解酶稱為β內酰胺酶[2]。19世紀40年代，β內酰胺類抗生素——青霉素首次被發現并廣泛使用以來，刺激了細菌產生β內酰胺酶的能力，現已報道的β內酰胺酶已達到300多種。因為β內酰胺酶種類多、性質復雜，而且在來源、結構、底物、抑制劑等方面存在許多不同，因而使得β內酰胺酶的系統分類較為復雜。

抗生素在用于治療和減輕人類和動物的疾病方面作用顯著，是20世紀最偉大發明之一[3]。在奶牛飼養過程中，采用抗生素藥物在提高牛奶產量和治療疾病方面做出了相當大的貢獻。但是抗生素殘留會對人類健康產生危害，同時也降低牛奶的品質，給牛奶經營者造成了經濟損失[4]。微生物法檢測是檢測乳中抗生素的傳統方法，也是當前乳中抗生素的最常用檢測手段[5]。但是由于牛奶中添加β內酰胺酶制劑導致牛奶抗生素檢測出現假陰性，使乳及乳制品的安全問題依然存在。因此，對分離純化β內酰胺酶及其降解產物的研究具有十分重要的意義。筆者選用大腸桿菌為供試菌株獲得β內酰胺酶，通過對該菌種發酵條件進行優化，提高β內酰胺酶活力。

2.2 初始pH對β內酰胺酶活力的影響

培養基的pH將影響培養基中某些物質的解離和中間代謝物的解離，從而影響微生物對營養成分的吸收和代謝[7]。因此，在發酵過程中控制適當的pH是非常重要的，它對于細胞的正常生長和外源基因的高效表達都有影響[8]。該試驗采用的pH在7.0～8.2，考察對菌體干重和酶活力的影響。

從圖2中可以發現，初始pH為7.8時β內酰胺酶活力最高，為160.99 U/ml；而菌體干重在pH 8.0時達到最大值。考慮到該試驗的目的是提高β內酰胺酶活力，因此確定發酵最適宜初始pH為7.8。

2.3 接種量對β內酰胺酶活力的影響 由圖3可以看出，1%的接種量過小，菌體干重較低，導致β內酰胺酶活力很低；3%～5%接種量時，雖然菌體大量增殖，但抑制了β內酰胺酶活力；6%的接種量過大，使發酵液黏稠從而抑制β內酰胺酶活力；當接種量為2%時，既可產生適量的菌體數量，又不會造成營養的過度消耗，β內酰胺酶活力較高，因此最適宜。

3 結論

通過試驗篩選和正交試驗得出大腸桿菌產β內酰胺酶的最佳發酵條件：溫度37 ℃，初始pH 7.8，接種量2%，裝液量65 ml/250 ml發酵瓶。使用最佳發酵條件對大腸桿菌進行培養，最終得到的β內酰胺酶活力為178.54 U/ml，比優化前提高了33%。但該研究β內酰胺酶的產量相對于工業化生產的需求還有一定的差距，下一步還要針對該菌株的發酵條件、β內酰胺酶的分離純化進行進一步的研究，從而更大程度地提高β內酰胺酶的產量。

參考文獻

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[3] 劉玉強.新型抗生素AGPM的分離純化和過程優化[D].天津：天津大學，2004.

[4] 顧欣.牛奶中青霉素殘留的微生物學檢測技術研究及應用[D].南京：南京農業大學，2005.

[5] 李延華，張蘭威，王偉君.微生物法檢測乳中抗生素殘留及假陽性產生的原因[J].食品與發酵工業，2005，31（8）：93.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2005年版（二部）[S].北京：化學工業出版社，2005：附錄84.

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[8] 丁蘭寶.重組大腸桿菌高密度發酵研究[D].無錫：江南大學，2008.