液體黑木耳菌種污染的快速鑒別

摘要 通過液體培養基中對木耳菌絲和常見的幾種雜菌菌絲的培養，用顯微攝像技術觀察比較其菌絲形態特點。結果表明，通過顯微技術比較液體培養基中的菌絲特點能清楚地區分出木耳液體培養基中的雜菌苗絲。

關鍵詞 黑木耳；液體；菌種；污染；鑒別

中圖分類號 S646.6 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05448-03

木耳Auricularia auriculajudae，屬于擔子菌門Basidiomycota，傘菌綱Agaricomycetes，木耳目Auriculariales，木耳科Auriculariaceae，其肉質細膩，營養豐富，含有人體必需的多種氨基酸、肝糖、維生素和礦質元素等，并具有降血脂、抗血栓、降血糖、清肺益氣、補血活血、鎮靜止痛等功效，是一種天然的食藥兼用菌[1-3]。

隨著食用菌栽培數量的不斷增加，菌種的培養成為重中之重。而液體菌種的培養與運用正不斷為食用菌栽培者所運用。由于栽培者在技術和經驗方面的欠缺對菌種的標準制作工藝和流程細節很難掌握，液體菌種的廣泛應用還存在一定的局限性。傳統菌種生產工藝，一般是由試管母種擴繁成二級種、三級種，生產周期長、污染率高、成本高、需要大量人工、管理困難[4]。

液體菌種與固體菌種相比具有純度高、活力強、萌發快、便于集中、快速工業化生產等優勢，是食用菌生產的方向[4]。液體菌種生產在國外已有很長的歷史，在我國也曾進行過，由于存在菌種單核化、設備投資過高等問題推廣較慢[4]。相對于黑木耳菌種的液體培養，由于木耳菌絲比側耳類的菌絲生產慢，菌絲生長較弱的特點，在培養中易感染雜菌，由于生長速度不同，雜菌生長快，培養基很快被雜菌占滿，如果接種前沒有對菌種進行雜菌檢查，其損失不可估量。筆者根據生產中常見的幾種易污染的雜菌特點與黑木耳菌菌絲在液體培養基中特點進行了對比，為液體菌種的推廣提供建議。

1 材料與方法

1.1 菌種 黑木耳菌種（豐收2號），酵母菌（釀酒酵母），霉菌（青霉、曲霉、根霉），枯草桿菌，以上菌種保存于長春師范大學生命科學學院。

1.2 培養基及培養方法

培養基：PDA液體培養基。

培養方法：搖床培養，溫度25 ℃，轉速160 rin，培養7 d。

檢測方法：顯微照相系統，在放大400～1 000倍鏡下觀察。

1.3 光學顯微結構觀察

在超凈工作臺內挑取少量不同菌齡的菌絲于載玻片上，滴0.2 ml 5%結晶紫染液，用接種針將菌絲完全拉開，蓋好蓋玻片，靜置5 min，待整個菌絲完全染色后，置于1 000 倍顯微鏡下觀察并拍照[5]。

2 結果與分析

2.1 木耳菌絲的形態特點 黑木耳是一種大型真菌，由菌絲體和子實體組成。菌絲體無色透明，由許多具橫隔和分支的管狀菌絲組成[6]。子實體是由朽木內的菌絲體發育而成，初時圓錐形、黑灰色、半透明（圖1、2）。

黑木耳除有性生活周期外，還有單核菌絲和雙核菌絲的無性生活周期[7]。雙核菌絲能斷裂形成雙核分生孢子或脫雙核化形成單核分 生孢子，在條件適宜時，都能分別萌發成單核菌絲或雙核菌絲，進入上述有性的生活周期（圖1、2）， 最為明顯的為形成的索狀聯合（圖1中箭頭所指下方、圖3）。

2.2 常見的霉菌菌絲的特點

霉菌指一類絲狀的真菌，霉菌的菌絲分為兩類，即無隔膜菌絲和有隔膜菌絲[8]。在固體培養基上，營養菌絲是伸入培養基內吸收營養成分的部分菌絲；生長在空氣中的菌絲為氣生菌絲，而氣生菌絲發育到一定階段，成為繁殖菌絲。霉菌菌絲在顯微鏡下是一種透明的管狀細絲，直徑為3～10 μm（圖4、5），根據菌絲中是否存在隔膜，可把霉菌菌絲分成無隔膜菌絲和有隔膜菌絲2種類型[9-10]。

2.2.1 無隔膜菌絲。菌絲中無隔膜，整團菌絲體就是一個單細胞，其中含有多個細胞核。這是低等真菌（即鞭毛菌亞門和接合菌亞門中的霉菌）所具有的菌絲類型[9-10]。常見的為根霉、毛霉等（圖4，6～8）。

2.2.2 有隔膜菌絲。菌絲中有隔膜，被隔膜隔開的一段菌絲就是一個細胞，菌絲體由多個細胞組成，每個細胞內有1個或多個細胞核[9-10]。這是高等真菌（即子囊菌亞門和半知菌亞門中的霉菌）所具有的菌絲類型。常見菌為青霉、曲霉，種類多，數量廣，有發達的菌絲體，有隔膜，多細胞（圖5、9）。

2.2.3 木耳菌絲與霉菌菌絲的區別。木耳菌絲最直觀的特點，也是擔子菌綱的特點，菌絲上都有一菌索（圖1）和索狀聯合（圖1箭頭指處）。而在被霉菌污染的培養基中除能見到無隔的菌絲，菌絲中沒有隔，為一個中空透明的菌絲（圖7）。還具有在菌絲團或菌絲的一端有孢子囊（圖10）。液體培養基還常夾雜有孢子（圖6）。而有隔菌絲在液體培養基中的菌絲片斷，通常呈竹節形，細胞內有的單核或多核，有的不明顯（圖5～6）。黑木耳菌絲片斷中細胞內的單核或雙核，且核較大（圖2）。

2.3 酵母菌與細菌的特點與區別

2.3.1 光學顯微鏡下單細胞真菌——酵母菌。酵母菌細胞的形態通常有球形、卵圓形、臘腸形、橢圓形、檸檬形或藕節形等[5]。比細菌的單細胞個體要大得多，一般為1～5 μm～5～20 μm，酵母菌無鞭毛，不能游動。最典型常見的酵母菌為酵酒酵母（圖11、12）。

2.3.2 細菌的光鏡下形態特點。

細菌是一類細胞細而短（細胞直徑約0.5 μm，長度0.5～5 μm）、結構簡單、細胞壁堅韌、以二等分裂方式繁殖和水生性較強的原核微生物[9-10]。普通的光鏡（10×100）可以把細菌的形態放大得很清楚（圖13），但要想看清其細胞器需要電鏡的協助。

2.3.3 酵母菌與細菌的區別。首先是酵母菌要比細菌大，酵母菌具有細胞核而細菌沒有細胞核，只有擬核也就是核區，如果酵母菌在進行出芽繁殖，可以清晰看到從菌體長出的芽，有些細菌具有鞭毛，而酵母菌不具有鞭毛，最明顯的是酵母菌有細胞核而細菌沒有細胞核且酵母菌內有細胞器包括內質網、線粒體等，細菌沒有細胞器，雖然只有核糖體但極微小，在普通光學顯微鏡下觀察不到（圖12、13）。

2.3.4 液體木耳培養基中酵母菌與細菌的區別。液體培養基中酵母菌與細菌如同木耳菌的“孢子”，但這所謂的“孢子”從大小形態上有很多區別，首先是形態上酵母菌個體較大，且在光鏡下具有明顯的核，而細菌個體小，但密度高，有規則的桿形和球形。在液體培養過程中，木耳菌絲不產生孢子，由于不斷地機械攪拌，菌絲體不斷地斷裂，表現為無性繁殖，液體中充滿了菌絲片斷。如果液體培養基中出現了球形或桿形的個體，就要進行仔細檢查，是否污染了細菌與酵母菌（圖14）。

3 小結

菌種染菌對木耳液體菌種的影響重大，關系到木耳生產的成敗。液體菌種生產過程中的菌種污染是指在液體培養基培養過程中侵入了生產菌以外的其他雜菌。菌種染菌對培養過程的影響可以從以下兩方面理解：首先，由于各種液體培養所用的菌種、培養基以及培養條件、產物性質的不同， 發生染菌后，培養基中的營養成分被消耗或代謝產物被分解，嚴重影響到新生菌絲的生成，導致液體菌種培養的失敗。其次，在種子培養期染菌，由于此時菌體濃度低，培養基營養豐富，較易染菌。此時一旦染菌，必須重新制做培養基，重新接種，重新培養菌。

培養過程中不同染菌時期分析：在菌種培養的前期染菌，由于菌體處于生長繁殖階段，菌體量少，生長慢，培養基感染雜菌后，雜菌生長的速度高于木耳菌絲的生長速度，與木耳菌爭奪培養基中的營養物質，嚴重干擾生產菌的正常生長、繁殖及產物的生成。在菌種培養的中期染菌，易導致菌體自溶，培養基產生大量泡沫，培養的菌絲體物質減少，此時期的染菌危害最大，一旦發現應盡快處理。在菌種培養的后期染菌，此時培養基中的營養物質基本已耗盡，且培養的產物已有較多的積累，此時期染菌很難發現。菌種培養是食用菌生產中最關鍵的一步，如果接種前沒有對菌種進行雜菌檢查，一旦接菌使用產生的危害，其損失不可估量。

參考文獻

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