黑曲霉菌絲體低溫與超低溫保藏方法比較研究

摘 要：黑曲霉是重要的發酵工業菌種，在工業酶學領域廣泛使用。文章對不產孢的糖化酶生產菌黑曲霉的菌絲體在低溫與超低溫下的保藏方法進行了比較，以探索一種適合于該黑曲霉及其衍生工程菌的保藏方法。結果標明：超低溫法保藏方法用于該菌種的長期保存具有良好的效果。

關鍵詞：黑曲霉；菌絲體；保藏

引言

黑曲霉（Aspergillus nige），半知菌亞門曲霉屬真菌中的一個常見種，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產品和土壤中，是重要的發酵工業菌種，可生產淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等。黑曲霉生產的酶制劑具有用量大、應用范圍廣、安全性好等特點。同時，黑曲霉也是表達真核蛋白的理想宿主，本實驗室前期建立了以糖化酶生產菌CICC2462為受體的食品級黑曲霉分泌表達系統，并利用該系統成功表達了木聚糖酶、甘露聚糖酶等重組酶制劑，展示出良好的應用前景。但是由于該菌株不產孢子，在其菌絲體的保藏過程中存在嚴重的菌種老化、衰退甚至死亡，對生產的影響極大。本研究對該黑曲霉的保藏方法進行研究，旨在探索適合于該菌種及其衍生工程菌的保藏方法。

1 材料和方法

1.1 菌種

不產孢的糖化酶生產菌黑曲霉CICC2462，由肇東市日成酶制劑公司提供。

1.2 培養基

1.2.1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基）：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，水1000ml，pH自然。

1.2.2 查氏培養基（MM培養基）：葡萄糖20g，（NH4）2SO4 5g，KH2PO4 15g，MgSO4 0.6g，CaCl2 0.6g，FeSO4·7H2O 0.005g，MnSO4·H2O 0.0016g，ZnSO4·7H2O 0.0014g，CoCl2 0.002g，pH自然。

1.3 培養方法

將菌種分別接種于PDA培養基和MM培養基中，23℃～28℃恒溫箱培養72～96h。

1.4 菌絲體保藏方法

1.4.1 低溫保藏法（-20℃冰箱保藏法）：2種培養基培養的菌絲體分別與培養基分離，注入40%甘油，用封口膜封存凍存管，將其放到4℃冰箱預凍半小時左右后，置于-20℃冰箱中保藏。低溫保藏法共6次實驗，保藏60個凍存管，前3次15天為一個保藏周期，中間2次20天為一個保藏周期，最后一次25天為一個保藏周期，每次PDA和MM兩種培養基各取出1組5個凍存管進行菌種的復蘇與活化。

1.4.2 超低溫保藏法（-80℃冰箱保藏法）：2種培養基培養的菌絲體分別與培養基分離，注入10%甘油，用封口膜封存凍存管，將其放到4℃冰箱預凍一小時左右后，置于-80℃冰箱中保藏。超低溫保藏法共4次實驗，保藏40個凍存管，前2次20天為一個保藏周期，后2次30天為一個保藏周期，每次PDA和MM兩種培養基各取出1組5個凍存管進行菌種的復蘇與活化。

1.5 菌種復蘇與活化

待菌種在冰箱中冷凍保藏一段時間后，將凍存管取出，立即放到38-40℃左右的水浴鍋中進行快速復蘇，并適當快速搖動凍存管，直到凍存管中結冰部分全部溶解為止。開啟凍存管，用移液器將凍存管中菌種移至對應的液體培養基中，注明日期、方法、培養基、管號。將裝有復蘇菌種的液體培養基，置于23～28℃搖床振蕩培養3天。3天后觀察。

2 結果與分析

2.1 低溫保藏條件下培養基比較

從圖1可以看出，低溫保藏法從第一個保藏周期15天開始到第六個保藏周期110天結束，PDA培養基和MM培養基的菌種的存活率趨勢基本上保持一致性。PDA培養基菌種在前兩個保藏周期（15-30天）的2組的5管菌種全部存活，第三、第四的兩個保藏周期（45-65天）的2組菌種中每組只存活了4管，最后兩個保藏周期（85-110天）的2組菌種中每組只存活了3管；MM培養基菌種在前三個保藏周期（15-45天）的3組的5管菌種全部存活，第四、第五的兩個保藏周期（65-85天）的2組菌種中每組只存活了4管，最后一個保藏周期（110天）的1組菌種中存活了3管。

PDA培養基菌種在前30天保藏周期全部存活，隨著保藏時間的延長，存活率降低到80%，85天時存活率降低為60%；MM培養基菌種在前30天保藏周期全部存活，隨著保藏時間的延長，存活率降低到80%，110天時存活率降低為60%。整體存活率上，MM培養基菌種要好于PDA培養基菌種。

2.2 超低溫保藏條件下培養基比較

從圖2可以看出，超低溫保藏法從第一個保藏周期20天開始到第四個保藏周期100天結束，PDA培養基和MM培養基的菌種的存活率趨勢基本上保持一致性。PDA培養基菌種在前三個保藏周期（20-70天）的3組的5管菌種全部存活，最后一個保藏周期（100天）的1組菌種中存活了4管；MM培養基菌種在前2個保藏周期（20-40天）的2組的5管菌種全部存活，后兩個保藏周期（70-10天）的2組菌種中每組存活了4管。

PDA培養基菌種在前70天保藏周期全部存活，隨著保藏時間的延長，100天時存活率降低到80%；MM培養基菌種在前40天保藏周期全部存活，隨著保藏時間的延長，70天存活率降低到80%。整體存活率上，PDA培養基菌種要好于MM培養基菌種。

2.3 兩種保藏溫度下不同培養基的差異

在低溫保藏條件下PDA培養基菌絲體的存活率呈現了低于MM培養基菌絲體的趨勢，而在超低溫保藏條件下PDA培養基菌絲體的存活率呈現了高于MM培養基菌絲體的趨勢，但總體的上升和下降的趨勢基本一致。

2.4 兩種保藏方法保藏時間與存活率的差異

低溫保藏法下，PDA培養基菌絲體在45天時存活率開始降低為80%，而MM培養基菌絲體在65天時存活率開始降低為 80%，隨著保藏時間的延長，PDA培養基菌絲體在85天時存活率降低到了60%，而MM培養基菌絲體則是在降低到60%。

超低溫保藏法下，PDA培養基菌絲體在100天時存活率降低為80%，而MM培養基菌絲體在70天時存活率開始降低為80%。

3 結束語

本研究中兩種菌種保藏方法的設備在很多實驗室都可以配備，整個過程操作簡單，費用低廉，安全性高，都適用于黑曲霉菌絲體保藏。本研究通過保藏時間和存活率的比較，結果表明：超低溫保藏法保藏黑曲霉菌絲體更好一些。

參考文獻

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作者簡介：吳瓊（1981，4-），女，講師，學士，研究方向為微生物學。

通訊作者：李杰，男，副教授，博士，碩士生導師，研究方向為分子遺傳學與基因工程。