黑曲霉菌絲體低溫與超低溫保藏方法比較研究

摘 要：黑曲霉是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，在工業(yè)酶學(xué)領(lǐng)域廣泛使用。文章對(duì)不產(chǎn)孢的糖化酶生產(chǎn)菌黑曲霉的菌絲體在低溫與超低溫下的保藏方法進(jìn)行了比較，以探索一種適合于該黑曲霉及其衍生工程菌的保藏方法。結(jié)果標(biāo)明：超低溫法保藏方法用于該菌種的長(zhǎng)期保存具有良好的效果。

關(guān)鍵詞：黑曲霉；菌絲體；保藏

引言

黑曲霉（Aspergillus nige），半知菌亞門曲霉屬真菌中的一個(gè)常見種，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中，是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，可生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等。黑曲霉生產(chǎn)的酶制劑具有用量大、應(yīng)用范圍廣、安全性好等特點(diǎn)。同時(shí)，黑曲霉也是表達(dá)真核蛋白的理想宿主，本實(shí)驗(yàn)室前期建立了以糖化酶生產(chǎn)菌CICC2462為受體的食品級(jí)黑曲霉分泌表達(dá)系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)成功表達(dá)了木聚糖酶、甘露聚糖酶等重組酶制劑，展示出良好的應(yīng)用前景。但是由于該菌株不產(chǎn)孢子，在其菌絲體的保藏過程中存在嚴(yán)重的菌種老化、衰退甚至死亡，對(duì)生產(chǎn)的影響極大。本研究對(duì)該黑曲霉的保藏方法進(jìn)行研究，旨在探索適合于該菌種及其衍生工程菌的保藏方法。

1 材料和方法

1.1 菌種

不產(chǎn)孢的糖化酶生產(chǎn)菌黑曲霉CICC2462，由肇東市日成酶制劑公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，水1000ml，pH自然。

1.2.2 查氏培養(yǎng)基（MM培養(yǎng)基）：葡萄糖20g，（NH4）2SO4 5g，KH2PO4 15g，MgSO4 0.6g，CaCl2 0.6g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005g，MnSO4·H2O 0.0016g，ZnSO4·7H2O 0.0014g，CoCl2 0.002g，pH自然。

1.3 培養(yǎng)方法

將菌種分別接種于PDA培養(yǎng)基和MM培養(yǎng)基中，23℃～28℃恒溫箱培養(yǎng)72～96h。

1.4 菌絲體保藏方法

1.4.1 低溫保藏法（-20℃冰箱保藏法）：2種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體分別與培養(yǎng)基分離，注入40%甘油，用封口膜封存凍存管，將其放到4℃冰箱預(yù)凍半小時(shí)左右后，置于-20℃冰箱中保藏。低溫保藏法共6次實(shí)驗(yàn)，保藏60個(gè)凍存管，前3次15天為一個(gè)保藏周期，中間2次20天為一個(gè)保藏周期，最后一次25天為一個(gè)保藏周期，每次PDA和MM兩種培養(yǎng)基各取出1組5個(gè)凍存管進(jìn)行菌種的復(fù)蘇與活化。

1.4.2 超低溫保藏法（-80℃冰箱保藏法）：2種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體分別與培養(yǎng)基分離，注入10%甘油，用封口膜封存凍存管，將其放到4℃冰箱預(yù)凍一小時(shí)左右后，置于-80℃冰箱中保藏。超低溫保藏法共4次實(shí)驗(yàn)，保藏40個(gè)凍存管，前2次20天為一個(gè)保藏周期，后2次30天為一個(gè)保藏周期，每次PDA和MM兩種培養(yǎng)基各取出1組5個(gè)凍存管進(jìn)行菌種的復(fù)蘇與活化。

1.5 菌種復(fù)蘇與活化

待菌種在冰箱中冷凍保藏一段時(shí)間后，將凍存管取出，立即放到38-40℃左右的水浴鍋中進(jìn)行快速?gòu)?fù)蘇，并適當(dāng)快速搖動(dòng)凍存管，直到凍存管中結(jié)冰部分全部溶解為止。開啟凍存管，用移液器將凍存管中菌種移至對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，注明日期、方法、培養(yǎng)基、管號(hào)。將裝有復(fù)蘇菌種的液體培養(yǎng)基，置于23～28℃搖床振蕩培養(yǎng)3天。3天后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫保藏條件下培養(yǎng)基比較

從圖1可以看出，低溫保藏法從第一個(gè)保藏周期15天開始到第六個(gè)保藏周期110天結(jié)束，PDA培養(yǎng)基和MM培養(yǎng)基的菌種的存活率趨勢(shì)基本上保持一致性。PDA培養(yǎng)基菌種在前兩個(gè)保藏周期（15-30天）的2組的5管菌種全部存活，第三、第四的兩個(gè)保藏周期（45-65天）的2組菌種中每組只存活了4管，最后兩個(gè)保藏周期（85-110天）的2組菌種中每組只存活了3管；MM培養(yǎng)基菌種在前三個(gè)保藏周期（15-45天）的3組的5管菌種全部存活，第四、第五的兩個(gè)保藏周期（65-85天）的2組菌種中每組只存活了4管，最后一個(gè)保藏周期（110天）的1組菌種中存活了3管。

PDA培養(yǎng)基菌種在前30天保藏周期全部存活，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，存活率降低到80%，85天時(shí)存活率降低為60%；MM培養(yǎng)基菌種在前30天保藏周期全部存活，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，存活率降低到80%，110天時(shí)存活率降低為60%。整體存活率上，MM培養(yǎng)基菌種要好于PDA培養(yǎng)基菌種。

2.2 超低溫保藏條件下培養(yǎng)基比較

從圖2可以看出，超低溫保藏法從第一個(gè)保藏周期20天開始到第四個(gè)保藏周期100天結(jié)束，PDA培養(yǎng)基和MM培養(yǎng)基的菌種的存活率趨勢(shì)基本上保持一致性。PDA培養(yǎng)基菌種在前三個(gè)保藏周期（20-70天）的3組的5管菌種全部存活，最后一個(gè)保藏周期（100天）的1組菌種中存活了4管；MM培養(yǎng)基菌種在前2個(gè)保藏周期（20-40天）的2組的5管菌種全部存活，后兩個(gè)保藏周期（70-10天）的2組菌種中每組存活了4管。

PDA培養(yǎng)基菌種在前70天保藏周期全部存活，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，100天時(shí)存活率降低到80%；MM培養(yǎng)基菌種在前40天保藏周期全部存活，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，70天存活率降低到80%。整體存活率上，PDA培養(yǎng)基菌種要好于MM培養(yǎng)基菌種。

2.3 兩種保藏溫度下不同培養(yǎng)基的差異

在低溫保藏條件下PDA培養(yǎng)基菌絲體的存活率呈現(xiàn)了低于MM培養(yǎng)基菌絲體的趨勢(shì)，而在超低溫保藏條件下PDA培養(yǎng)基菌絲體的存活率呈現(xiàn)了高于MM培養(yǎng)基菌絲體的趨勢(shì)，但總體的上升和下降的趨勢(shì)基本一致。

2.4 兩種保藏方法保藏時(shí)間與存活率的差異

低溫保藏法下，PDA培養(yǎng)基菌絲體在45天時(shí)存活率開始降低為80%，而MM培養(yǎng)基菌絲體在65天時(shí)存活率開始降低為 80%，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，PDA培養(yǎng)基菌絲體在85天時(shí)存活率降低到了60%，而MM培養(yǎng)基菌絲體則是在降低到60%。

超低溫保藏法下，PDA培養(yǎng)基菌絲體在100天時(shí)存活率降低為80%，而MM培養(yǎng)基菌絲體在70天時(shí)存活率開始降低為80%。

3 結(jié)束語

本研究中兩種菌種保藏方法的設(shè)備在很多實(shí)驗(yàn)室都可以配備，整個(gè)過程操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，安全性高，都適用于黑曲霉菌絲體保藏。本研究通過保藏時(shí)間和存活率的比較，結(jié)果表明：超低溫保藏法保藏黑曲霉菌絲體更好一些。

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作者簡(jiǎn)介：吳瓊（1981，4-），女，講師，學(xué)士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。

通訊作者：李杰，男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉肿舆z傳學(xué)與基因工程。