大腸桿菌檢測方法的研究

摘要：大腸桿菌是人和動物腸道中的常居菌，在食品衛生質量的評價和控制中，通常將其作為指示菌來評價食品糞源性污染的程度。本文簡述了大腸桿菌的傳統檢測方法-濾膜法、多管發酵法、平板計數法等技術，以及一些快速方法-酶底物法、聚合酶技術，這些方法應用縮短了檢測流程和時間，為在大工業生產中微生物控制提供了具有時效性的檢測技術。

關鍵詞：大腸桿菌 檢測技術 食品安全

0 引言

大腸桿菌又稱大腸埃希氏菌（Escherichia coli），在1885年由德國細菌學家Theodor Escherich分離出來的，其屬于細菌域、變形菌門、γ—變形菌綱，能夠在人和動物的腸道中正常寄居，隨著人和動物的糞便排出體外。其中五種腸毒素性大腸桿菌與人類疾病相關：腸毒素性、致病性、出血性、侵襲性和粘附性大腸桿菌。乳品中大腸桿菌一旦被檢測出，就意味著其受到直接或間接的污染。因此，該菌很早就已經被用作食品糞源性污染的衛生學指標，并相應的出現了大量的檢測方法。本研究介紹以往采用的傳統方法，及目前所使用的新檢測技術。

1 大腸桿菌的生物學特性及其致病性

1.1 生物學特性

大腸桿菌體積約為0.6-0.7μm3兩端鈍圓的短桿菌，有時會近似球狀菌。有些菌株有莢膜或微莢膜，無芽孢，含有4-6根鞭毛，會游動，長有菌毛。該類菌是需氧或兼性厭氧性菌，最適生長溫度為37攝氏度。屬于單細胞微生物，其結構特點為：細胞壁、細胞膜、細胞質和核質。細胞壁的內測是細胞膜，細胞壁主要由膚聚糖和外部膜結構組成，具有堅韌而富有彈性的膜狀結構；細胞膜主要是由磷脂及蛋白質組成；細胞質是細菌進行新陳代謝的場所，含有蛋白質、脂類、水、核酸等物質成份。

1.2 致病性

大腸桿菌一般沒有致病性，但當大腸桿菌的菌落數超過人體自身的承受能力時就可能產生疾病隱患。嬰兒感染大腸桿菌可能引起新生兒腦膜炎，老人以及免疫力低下的人群可能會引起敗血癥等疾患；腸道感染時會出現如水瀉、帶血腹瀉、腹絞痛、發燒、嘔吐等，嚴重時，可并發急性腎炎；如果腸道以外的器官被大腸桿菌感染，則可能引起人體腸胃炎、尿道炎、膀胱炎、闌尾炎等。

2 測定方法

傳統檢測方法：多管發酵法、比濁法、稀釋平板計數法等；其特點：不具時效性，耗力費時，操作繁復，其檢測周期難以適應當前快速判斷污染源的要求。近年來，隨著食品衛生和安全控制要求的不斷深化，科學技術（生物化學、遺傳學、免疫學、分子生物學等學科）的不斷發展，新的快速診斷檢測大腸桿菌污染的方法已被國內外研究人員開發出來，如酶底物法、聚合酶鏈反光法、免疫技術、熒光分析法等。

2.1 傳統方法

2.1.1 多管發酵法

多管發酵法是根據該類細菌能夠使乳糖發酵產酸產氣，鏡檢無芽孢、呈鈍圓桿狀，革蘭氏染色后呈陰性等特征。因為以上特性，因此用此種方法檢測水樣中大腸菌群。。根據大腸桿菌產生的β—葡萄糖醛酸酶能夠分解熒光底物釋放出熒光產物的特性，將大腸桿菌接種在含有熒光底物培養基，放在44.5攝氏度的恒溫培養箱中培養24小時，觀察在紫外光下是否產生熒光。

2.1.2 平板計數法

平板計數法是統計活菌數的有效方法，其原理是將待測活菌稀釋為單個的細胞，將單個的細胞培養成肉眼看得見的單個菌落，再根據稀釋倍數推測菌數。具體做法是將大腸桿菌樣品用LB培養液溶解，稀釋至107或108倍，分別取0.lmL大腸桿菌在37℃條件下培養48h后，計算每個稀釋液于6個固體培養基的平皿中單個菌落數，并根據平皿中的稀釋倍數測算出待測樣品的菌數。單菌落的生產可能不止一個細胞產生的，因此采用平板計數法，其測量結果低于實際的菌數。

2.1.3 濾膜法檢測水中大腸菌群

濾膜檢測技術是目前最為普遍采用的微生物檢測方法，也是國外普測技術。采用大腸菌群的濾膜法，首先用微孔濾膜（孔徑為0.45pm）過濾水樣，經過抽濾細菌則被留在濾膜上，剪下貼在含有乳糖的培養基上在37攝氏度下培養24h。通過計算濾膜上顯現的紫紅色菌落來確定菌數。

2.2 大腸桿菌新的測定方法

2.2.1 酶底物法

酶底物法的基本原理是大腸桿菌在含有乳糖的培養基上會產生β—半乳糖苷酶，這種物質可以分解色原底物釋放出“色原體”，改變培養基顏色。酶底物法結果準確、無培養基干擾又可減少雜菌干擾，且假陽性與假陰性反應低，出具結果快（18-24小時出具報告），具有容易判操、方法簡便等特點，因此入選國家標準GBT5750.12—2006。

2.2.2 聚合酶鏈反應

聚合酶鏈反應是一種新技術，是利用DNA聚合酶物質模擬天然DNA復制過程，在實驗室條件下特異性擴增DNA（或RNA）片段，同時體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。2～4分鐘即可完成一個新周期由高溫變性、低溫退火、適溫延伸等幾步反應擴增的循環，待擴增目的基因擴增幾百萬倍，只需要2～3小時。

2.3 免疫檢測

通過檢測反應物上的指示物，以抗原和抗體間的特異性反應為基理，對抗原或抗體進行定性或定量，檢測的快速高效方法。目前快速檢測技術普遍采用的方法有： ELISA、反向被動乳膠凝集法、乳膠凝集法、酶聯熒光分析法、免疫沉淀法、免疫血清法、抗體印跡法等。

2.4 化學法

化學發光法是一種化學分析方法。主要是利用物質在進行化學反應時會伴隨有光輻射的現象的原理，此方法可以檢測到極低細菌濃度，但需要足夠長的培養時間，最低可以檢測到食品中的幾個菌落。科學研究者利用對大腸桿菌的滲透可以減低胞內酶的擴散障礙，加速基底向酶的傳遞這一特性來提高檢測信號。

3 小結

傳統檢測需要時間較長，檢驗效率相對低，但檢測方法仍然被廣泛的應用于食品衛生控制技術，并被納入國家檢測標準，被政府相關檢測機構及企業長期采用。隨著科學技術和微生物控制技術的發展，快速檢測大大的提高了檢測效率，對食品安全微生物控制起到了關鍵性的成效。

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