TLR4抗體對Aβ1—42誘導AD小鼠模型神經功能作用

摘要：目的 探討TLR4抗體對Aβ1-42誘導阿爾茨海默病小鼠模型學習記憶功能的影響。方法 采用雙側海馬注射Aβ1-42的方法制備小鼠AD模型，以C57BL/6小鼠為實驗對象，隨機分為四組，AD組，抑制劑組，AD+抑制劑組，生理鹽水組，水迷宮實驗觀測小鼠行為學改變。結果 AD組模型與生理鹽水組比較，其潛伏期延長，穿越平臺次數減少，游泳距離、內環(huán)時間及內環(huán)距離延長，游泳速度減慢。AD+抑制劑組與AD組比較，其潛伏期縮短，穿越平臺次數相對增多，游泳距離、內環(huán)時間及內環(huán)距離縮短。生理鹽水組及抑制劑組屬于對照組，這兩組之間無顯著差異。結論 給予TLR4抗體可以改善AD小鼠的學習記憶功能。

關鍵詞：TLR4；阿爾茨海默病；Aβ1-42

阿爾茨海默病是一種中樞神經退行性疾病，早期表現(xiàn)為記憶力減退和生活自理能力下降，最終導致認知功能障礙缺失，精神行為異常及生活自理能力完全消失[1]。目前，AD的發(fā)病機制尚未清楚，其中腦內慢性炎癥改變作為病因之一越來越受到重視。Toll樣受體4信號轉導通路為炎癥改變重要通路之一，抑制這一信號轉導通路，是否可以改善AD小鼠的學習記憶功能，本文通過制作小鼠模型來探討這一問題。

1資料與方法

1.1試劑與儀器 Aβ1-42（貨號A9180）；MAb-mTLR4/MD2（貨號30-01-mt4m）；腦立體定位儀；泰盟Morris水迷宮。

1.2實驗動物及分組 選用周齡為12～16w，體重25～30g的健康雌性C57BL/6J小鼠48只，將小鼠完全隨機分為AD組，AD+抑制劑組，生理鹽水組，抑制劑組，每組12只。

1.3模型制備 ①AD模型制備：將小鼠按0.004ml/g體重的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，俯臥固定于腦立體定位儀上。常規(guī)備皮消毒，頭頂部正中切開，暴露前囟，參照小鼠腦立體定位儀，每只小鼠雙側海馬各注射1μlAβ1-42（濃度為5μg/μl）；坐標為前囟后2.2mm，矢狀縫雙側旁開1.5mm，既為海馬的體表部位，進針深度即為顱骨表面向下1.5mm，注射時速度為1μl/min，注射后留針8min，拔針時速度為1mm/min，拔出針頭后暫不縫合，用無菌生理鹽水紗布覆蓋顱骨表面，使其保持濕潤，40min后，用同樣的方法，在同一部位注射等體積的生理鹽水雙側各1μl，在留針8min后，按照同樣的出針速度拔出針頭，給與消毒縫合，白熾燈光照射，促進清醒及保溫，然后單籠飼養(yǎng)，防止小鼠之間互相咬傷。②生理鹽水組模型制備：注射部位、方法同①，先注射等體積的無菌生理鹽水各1μl，40min后再次在同部位注射等體積生理鹽水1μl。③AD+抑制劑組模型制備：按照①的方法將1μlAβ1-42（濃度為5μg/μl）注射至小鼠兩側海馬，注射部位及方法相同，留針8min后，按1mm/min出針，40min后，用同樣的方法，在同一部位注射等體積的MAb-mTLR4/MD2雙側各1μl（濃度為1μg/μl）。④抑制劑組模型制備：注射部位、方法同①，先雙側海馬注射濃度為1μg/μl的MAb-mTLR4/MD2各1μl，40min后在同部位注射生理鹽水各1μl。

1.4學習記憶能力檢測 術前給予3d行為學測試，讓小鼠在水迷宮中自由游泳以熟悉環(huán)境，上下午各 1 次，每次時間為 60s，如果 60s 內找不到平臺，由試驗者將小鼠放到平臺上10s 以熟悉環(huán)境。正式試驗過程中，小鼠如果在60s 內找不到平臺也將其放在平臺上 10s并將潛伏期記為 60s，術后第8d開始正式測評，連續(xù)測評3d，上下午各一次，第3d下午定航實驗完畢后，撤掉平臺，選取遠離目標象限的第一象限為入水點，游泳時間為 60s記錄小鼠在原平臺處停留時間以及穿越次數，此為空間搜索實驗。

1.5統(tǒng)計結果分析 將第3d的平均成績作為本次試驗的結果用于分析比較，使用SPSS16.0 軟件，數據用x±s表示，采用單個重復測量因素方差分析，P<0.05具有統(tǒng)計學差異。

2結果

水迷宮檢測：①AD組vs AD+抑制劑組，AD組vs生理鹽水組的3d潛伏期時間（s）、內環(huán)時間（s）的時間延長，內環(huán)距離（cm）增加及穿越平臺次數減少，P<0.05，具有統(tǒng)計學差異；生理鹽水組vs抑制劑組之間無明顯差別，P>0.05，無統(tǒng)計學差異。②AD組vs生理鹽水組的3d游泳速度（cm/s）的速度減慢，P<0.05，有統(tǒng)計學差異；AD組vsAD+抑制劑組比較P>0.05，無統(tǒng)計學學差異；生理鹽水組vs抑制劑組比較P>0.05，無統(tǒng)計學差異。

3討論

AD發(fā)病機制尚不清楚，目前認為其是多種發(fā)病因素共同參與的異質性疾病，主要涉及Aβ沉積、Tau蛋白過度磷酸化、炎癥反應等機制[2]。其中，炎性反應是AD核心病理機制，炎癥介質促進AD的發(fā)生與發(fā)展。

TLRs信號轉導通路直接參與免疫炎癥反應的激活和調控，TLR4調控炎癥反應主要有兩個通路，MyD88-依賴性通路及TRIF-依賴性通路。有研究表明AD 腦中TLR4 表達增多[3]，TLR4以 LPS為配體，激活小膠質細胞后可通過增加細胞過氧化負荷，上調炎癥因子及增加Aβ蛋白沉積，促發(fā)AD 的發(fā)生；TLR4相關信號傳導通路也參與了Aβ1-42蛋白沉積后對神經元的毒性作用。如外源性Aβ1-42蛋白能與 TLR4發(fā)生相互作用，激活該信號通路進一步促發(fā)上述炎癥因子，尤其是 TNFA的產生。而且這種作用可以被特異性的抗 TLR4抗體所部分阻斷。在 TLR4 信號轉導通路被TLR4 抗體阻斷后，NF‐κB p65 表達、 TNFα分泌水平明顯下降[4，5]。這些實驗提示TLR4調節(jié)的信號通路參與了AD的發(fā)病過程。本實驗應用Aβ1-42雙側海馬注射制備小鼠AD模型，并給與海馬內注射TLR4抗體，以觀察阻斷TLR4調節(jié)的信號通路對小鼠AD模型學習記憶功能的影響。結果顯示：AD組模型與生理鹽水組比較，其潛伏期延長，穿越平臺次數減少，游泳距離、內環(huán)時間及內環(huán)距離延長，游泳速度減慢。AD+抑制劑組與AD組比較，其潛伏期縮短，穿越平臺次數相對增多，游泳距離、內環(huán)時間及內環(huán)距離縮短。由于注射TLR4的抗體，阻斷TLR4介導的炎癥信號轉導通路，從而減輕AD的癥狀，使其與AD組比較，在記憶功能方面略有改善。生理鹽水組及抑制劑組屬于對照組，這兩組之間無顯著差異，說明TLR4抑制劑對小鼠無神經毒性，不干擾AD模型的制作。

綜上所述，通過給予AD小鼠注射TLR4抗體，從行為學上可以改善小鼠的學習記憶功能，在今后的實驗中，我們將應用western Blot、EMSA等方法對TLR介導的信號轉導通路在AD的病理生理過程中的作用及機制進行研究，如測定MyD88依賴性通路和TRIF依賴性通路中蛋白激酶的表達及NFκB和IRF-3的活性等。

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編輯/申磊