毛細管氣相色譜法測定恩替卡韋原料中的殘留溶劑

摘要：目的 建立恩替卡韋原料中10種有機溶劑殘留量的分離測定方法。方法 采用毛細管氣相色譜法，程序升溫，二甲基亞砜為溶解介質，色譜柱為DB-624毛細管柱，載氣為高純氮氣，FID檢測器，測定了恩替卡韋原料藥中10種有機溶劑殘留量。結果 10種有機溶劑完全分離；檢測限分別為3.3、3.0、0.9、3.1、4.5、1.0、1.5、3.0、1.7、0.5μg/ml；在一定濃度范圍內線性良好，R為0.9997～1.0000；進樣精密度良好，RSD（n=6）為0.8%～2.9%；加樣回收率良好，各溶劑的平均回收率（n=9）為98.1%～100.8%，RSD（n=9）為1.5%～4.0%。結論 本方法精密、靈敏、準確，可適用于恩替卡韋原料中有機溶劑殘留量的測定。

關鍵詞：恩替卡韋；殘留溶劑；毛細管氣相色譜法

恩替卡韋系鳥嘌呤核苷類似物，已日益成為抗HBV的一線藥物[1]。恩替卡韋在合成過程中使用10種有機溶劑，本實驗建立了一種毛細管氣相色譜法同時對上述10種溶劑進行分離測定，操作簡便，方法精密度好、靈敏度高，結果準確可靠。

1儀器與試劑

島津GC2010氣相色譜儀，FID檢測器；DB-624毛細管柱 （30m*0.25mm*1.40μm）；

恩替卡韋原料（國內某企業提供，批號：121212、130128、130320）

二氯甲烷、正己烷、四氫呋喃、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、二甲基亞砜均為色譜純，叔丁基甲基醚和叔丁醇為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：DB-624毛細管柱 （30m*0.25mm*1.40μm）；采用程序升溫，柱溫40℃維持5min，然后以15℃/min的升溫速率升至100℃，維持2min，再以30℃/min的升溫速率升至180℃，維持5min；進樣口溫度230 ℃，檢測溫度260℃，氫火焰離子化檢測器；載氣為高純氮氣。

2.2溶液配制 對照品溶液 精密稱取二氯甲烷、正己烷、四氫呋喃、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙酸乙酯、叔丁基甲基醚、乙醇、叔丁醇各適量，置同一量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋制成每1ml中各含0.6mg、0.29mg、0.72mg、3.0mg、0.88mg、5.0mg、5.0mg、5.0mg、5.0mg和5.0mg的溶液，作為對照儲備液，精密量取1.0ml～50ml量瓶，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液 精密稱取恩替卡韋約0.2g，置10ml量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.3系統適用性試驗 取10種溶劑各適量，分別用二甲基亞砜稀釋后，照2.1項下色譜條件，各進樣1.0μl，進行各溶劑的定位；再取空白溶劑二甲基亞砜和2.2項下對照品溶液各1.0μl進樣，結果，空白溶劑無干擾，10種有機溶劑依次出峰，各溶劑峰均完全分離，最難分離的溶劑為二氯甲烷和叔丁醇，其分離度為1.98，各溶劑峰的理論板數均大于9607，見圖1，圖2。

2.4檢測限 取各溶劑，用二甲基亞砜逐步稀釋成一系列低濃度的溶液，照2.1項下色譜條件，各進樣1.0μl，測得各溶劑的檢測限（S/N≥3），結果二氯甲烷、正己烷、四氫呋喃、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙酸乙酯、叔丁基甲基醚、乙醇和叔丁醇的檢測限分別為3.3、3.0、0.9、3.1、4.5、1.0、1.5、3.0、1.7、0.5μg/ml。

2.5線性范圍 分別精密量取2.2項下的對照儲備液0.2ml、0.5ml、1.0 ml、2.0ml、5.0 ml置50ml量瓶中，分別加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻。照2.1項下色譜條件，各進樣1.0μl。以各成分的濃度為橫座標，峰面積為縱座標進行線性回歸，結果見表1。各溶劑在表1所示的濃度范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系，回歸線的相關系數R為0.9997～1.0000。

2.6進樣精密度 取2.2項下對照品溶液1.0μl，照2.1項下色譜條件，重復進樣6次，考察本方法的進樣精密度，結果甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、叔丁醇、叔丁基甲基醚、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃和N，N-二甲基甲酰胺的峰面積的RSD（n=6）分別為：2.5%、2.9%、2.8%、2.4%、2.8%、3.2%、0.8%、2.8%、1.9%和1.7%，均小于10%，符合直接進樣的氣相色譜法的進樣精密度要求。

2.7加樣回收率 取2.2項下對照儲備液1.0ml，置10ml量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，作為母液。取恩替卡韋原料（批號：121221）共10份，每份約0.2g，分別置10ml量瓶中，其中1份作為空白樣品，另9份中分別精密加入前述母液1.6ml、2.0ml、2.4ml，分別加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，混勻，作為供試品溶液。分別取2.2項下對照品溶液及上述供試品溶液各1.0μl，照2.1項下色譜條件進樣。按外標法計算得各供試品溶液中各溶劑的實測含量，扣除空白樣品中各溶劑的含量得到各溶劑的測得量，以測得量除以加入量計算回收率。結果顯示，各溶劑的平均回收率（n=9）為98.1%～100.8%，RSD（n=9）為1.5%～4.0%，符合測定要求，因此本方法準確度好。

2.8樣品測定 取恩替卡韋原料及各溶劑，照2.2項下方法配制供試品溶液和對照品溶液，照2.1項下色譜條件分別進樣1.0μl。按外標法以峰面積計算樣品中各溶劑的殘留量。結果顯示，130320批原料各溶劑均未檢出；121212批和130128批原料檢出甲醇和丙酮，但含量均低于ICH規定的限度，其他各溶劑均未檢出。

3討論

3.1藥物殘留溶劑的測定對于保證藥物的安全性、指導生產工藝改進具有重要的意義。ICH在關于有機溶劑殘留量的指導原則中，將二氯甲烷、正己烷、四氫呋喃、甲醇和N，N-二甲基甲酰胺列為第二類溶劑，應限制使用，其限度分別為：0.06%、0.029%、0.072%、0.3%、0.088%；將丙酮、乙酸乙酯、叔丁基甲基醚、乙醇列為三類溶劑，為GMP或其他質量要求限制使用，其限度均為0.5%；本方法中上述各溶劑的檢測限均遠低于限度規定。雖然目前ICH對叔丁醇未作規定，但本方法中其檢測限相當于0.0025%的限度，檢測靈敏度很高。

3.2因測定溶劑較多，各溶劑極性和沸點差異較大，因此我們選擇了中等極性的DB-624毛細管柱進行試驗，摸索了不同的升溫程序對各溶劑間分離度的影響，最終確定了本實驗中的升溫程序，且考察了溫度的微小波動對分離度無影響。經過系統適用性、線性、進樣精密度、加樣回收率試驗的驗證，本方法能同時準確可靠的測定恩替卡韋中的10種殘留溶劑，且每份樣品的分析過程約20min，快速簡便。

參考文獻：

[1]楊少偉.淺談恩替卡韋治療慢性乙肝的臨床研究[J].醫學信息（上旬刊），2011，1，24（1）：168.

編輯/孫杰