免疫組化和PCR方法檢測(cè)乳癌腋窩淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的比較

摘要：目的 探討通過(guò)不同方法檢測(cè)腋窩淋巴結(jié)MUC1基因表達(dá)，以提高微轉(zhuǎn)灶診斷率。方法 收集2010～2012年我院收住的手術(shù)患者26例，108個(gè)常規(guī)組織學(xué)檢查陰性的腋窩淋巴結(jié)，分別用免疫組化及RT-PCR法測(cè)定MUC 1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 MUC 1 mRNA陽(yáng)性檢出率為66%，明顯高于蛋白表達(dá)檢出率21%（P<0.05）。結(jié)論 建立起MUC 1 基因的RT-PCR分析法，進(jìn)一步提高微轉(zhuǎn)移灶診斷率，較免疫組化更為敏感。

關(guān)鍵詞：MUC 1 粘蛋白；乳腺腫瘤；免疫組化；RT-PCR

淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是指常規(guī)病理難以發(fā)現(xiàn)的<2 mm的癌轉(zhuǎn)移灶[1]，其存在與否會(huì)直接影響患者的預(yù)后。隨著技術(shù)的進(jìn)步，微轉(zhuǎn)移檢測(cè)先后出現(xiàn)連續(xù)切片法[2]、免疫組化法[3]和PCR法[4]等。本文用不同方法進(jìn)行了微轉(zhuǎn)移灶診段的研究。以評(píng)估并建立乳腺淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移灶診斷的較佳方法。

1資料與方法

1.1一般資料 20例乳腺癌組織（以浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌為主）及對(duì)應(yīng)108個(gè)腋窩淋巴結(jié)手術(shù)切除標(biāo)本、26例乳腺良性腫瘤標(biāo)本取我院2010～2012年收住的手術(shù)患者，所取標(biāo)本在術(shù)后1.5 h內(nèi)置液氮中保存，并切留部分相應(yīng)常規(guī)病理學(xué)檢查及免疫組化分析。另取手術(shù)膽結(jié)石患者的肝十二腸韌帶淋巴結(jié)作為正常無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)對(duì)照。

1.2.1免疫組化研究 免疫組化染色用SP法。操作方法按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每批設(shè)已知乳腺癌陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。陽(yáng)性判斷：胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿無(wú)棕黃色顆粒為陰性細(xì)胞。判定標(biāo)準(zhǔn)：（-）：陽(yáng)性細(xì)胞占10%以下；（+）：陽(yáng)性細(xì)胞比例為10%～30%（++）：陽(yáng)性細(xì)胞比例為30%-50%（+++）：陽(yáng)性細(xì)胞比例>50%者。根據(jù)細(xì)胞漿粽染再結(jié)合細(xì)胞形態(tài)確定微轉(zhuǎn)移。

組織粽RNA提供采取異硫氰酸胍。AMV逆轉(zhuǎn)錄酶42℃作用60 min合成cDNA，再以此為模板結(jié)進(jìn)行PCR循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。陰性對(duì)照用未做逆轉(zhuǎn)錄的總RNA做模板，空白對(duì)照在擴(kuò)增時(shí)不加Taq DNA聚合酶。RT-PCR結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物10，進(jìn)行2%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，Kodak Digital Science凝膠成像系統(tǒng)照，得出結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 兩種結(jié)果統(tǒng)計(jì)處理用χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 MUC 1基因免疫組化結(jié)果 MUC 1蛋白在癌變細(xì)胞中表達(dá)于胞膜和胞漿，微轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為單個(gè)散在或2～3個(gè)及數(shù)個(gè)聚集成小團(tuán)狀的癌細(xì)胞位于淋巴結(jié)內(nèi)。個(gè)別淋巴結(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞，漿細(xì)胞等可見(jiàn)MUC 1交叉反應(yīng)，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)部位及染色特征可以區(qū)分，見(jiàn)表1。

2.2乳癌患者M(jìn)UC 1 mRNA 表達(dá)情況 臨床樣本MUC 1 和內(nèi)參照B2-微球蛋白基因擴(kuò)增分別得到288 bp和150 bp左右的條帶，與所設(shè)計(jì)的片段大小相符。空白對(duì)照組和陰性對(duì)照均未見(jiàn)擴(kuò)增條帶。

20例乳腺患者的108個(gè)HE染色未見(jiàn)轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中71個(gè)經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后有MUC 1 mRNA表達(dá)，陽(yáng)性檢出率為66%。8例乳腺組織，7個(gè)HE陽(yáng)性淋巴結(jié)及6例正常乳腺組織MUC 1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為100%、100%及100%，見(jiàn)表2。

2.3不同方法檢測(cè)MUC 1 基因表達(dá)結(jié)果比較 在109個(gè)常規(guī)病理學(xué)檢查陰性的淋巴結(jié)中，免疫組化發(fā)現(xiàn)23個(gè)有MUC 1 蛋白的表達(dá)，再進(jìn)一步行RT-RCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)71個(gè)表達(dá)MUC 1 mRNA，表明腫瘤隱蔽淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的存在，這種轉(zhuǎn)移可能是一個(gè)或數(shù)個(gè)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移引起的。RT-PCR法使微轉(zhuǎn)移灶的診斷由免疫組化的21%增加到66%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩種方法陽(yáng)性檢出率有顯著差異（P<0.005），提示RT-RCR法更為敏感，大大提高了微轉(zhuǎn)移灶的診斷率。

3討論

乳癌發(fā)病率逐年上升，目前以外科手術(shù)為最主要的治療手段。影響乳癌患者術(shù)后預(yù)后的因素很多，其中腋窩淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移量、水平和部位對(duì)臨床選擇治療方案及預(yù)后評(píng)估至關(guān)重要。研究表明：惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是主要致死因素，而淋巴道轉(zhuǎn)移是主要轉(zhuǎn)移途徑之一，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與生存率呈負(fù)相關(guān)[5]。有統(tǒng)計(jì)表明淋巴結(jié)陰性的乳癌患者術(shù)后5年內(nèi)仍有20%左右死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，可以認(rèn)為這些患者在診斷之初可能就存在隱蔽的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或全身轉(zhuǎn)移[6-7]，用常規(guī)的組織病理方法甚至免疫組化方法都不易發(fā)現(xiàn)，需要尋找更為敏感有效的標(biāo)志物或方法來(lái)解決這一問(wèn)題。

檢測(cè)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞，需利用能區(qū)別于轉(zhuǎn)移部位組織而腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的生物學(xué)標(biāo)志物。因乳癌絕大數(shù)都發(fā)源于上皮組織，故上皮組織的某些特異性標(biāo)志物可作為轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物用于淋巴結(jié)中微轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)。MUC1黏蛋白是一種高分子量膜糖蛋白，其分布具有明顯的組織特異性，主要在于某些上皮組織和器官中，如乳腺，胰腺，卵巢和結(jié)腸等，特別是在所有正常及乳癌組織中均表達(dá)而在間葉組織來(lái)源的淋巴結(jié)中不表達(dá)。

靈敏特異的RT-PCR法的應(yīng)用，隨著循環(huán)次數(shù)的不同，Taq酶用量的不同可能會(huì)提高方法的敏感性，但也由此導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的可能，需不斷改進(jìn)。我們用PCR法對(duì)微轉(zhuǎn)移研究的最終目的是選擇病理學(xué)上腋淋巴結(jié)陰性乳癌患者中的高危復(fù)發(fā)人群，以指導(dǎo)臨床預(yù)后，而并非是該方法的最大敏感性及對(duì)臨床分期的具體知道。目前對(duì)于高靈敏度方法檢出的微轉(zhuǎn)移灶其生理意義仍有爭(zhēng)議。有研究表明，存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的乳癌患者預(yù)后不良。微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞進(jìn)入淋巴結(jié)后可能有3種轉(zhuǎn)歸：①繼續(xù)增生形成大轉(zhuǎn)移灶最終全身轉(zhuǎn)移；②被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除；③暫時(shí)進(jìn)入靜止期，待環(huán)境適宜時(shí)，再增生形成大的轉(zhuǎn)移瘤。故RT-PCR法檢出微轉(zhuǎn)移的患者并非一定復(fù)發(fā)，但可能提示有形成轉(zhuǎn)移傾向。相信隨著觀察例數(shù)的增多，隨訪時(shí)間延長(zhǎng)，微笑轉(zhuǎn)移灶的臨床意義會(huì)更加明顯。

編輯/肖慧