毒胡蘿卜素誘導大鼠肺泡巨噬細胞凋亡的實驗研究

摘要：目的 初步探討內質網應激特異性誘導劑毒胡蘿卜素（TG）對肺泡巨噬細胞（AM）增殖和凋亡的影響。方法 分離純化AM并體外培養， 經不同濃度的TG（1μM，2μM，4μM，8μM）干預24h后，MTT檢測細胞存活率，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染，流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況并在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態。結果 與對照組比較，經過TG干預24h后的細胞存活率下降，凋亡率增高且具有濃度依賴性，P<0.05。結論 毒胡蘿卜素具有抑制AM增殖，誘導AM凋亡的作用。

關鍵詞：毒胡蘿卜素；肺泡巨噬細胞；凋亡；肺纖維化

肺纖維化的病因很多，但是不同病種的肺間質纖維化改變都是從肺泡炎開始，在發展和修復的過程中逐步導致肺纖維化的傾向，到了晚期大多認為纖維化是不可逆的，治療難度較大。其實在早期大部分是肺泡炎和部分纖維化并存，其肺泡炎是完全可以逆轉的，因此在病情發展的早期，爭取可逆部份和時間，控制病情發展顯得尤為重要。肺泡巨噬細胞（AM）是參與肺部炎癥的主要免疫細胞，也是氣道局部炎癥反應的主要始動細胞[1]。活化的肺泡巨噬細胞釋放的細胞因子和炎性遞質在早期肺損傷中起重要作用[2]，在肺纖維化的發展過程中，AM被激活并大量的增殖，促進了肺間質炎癥的發展，從而最終形成肺間質的纖維化。

有研究結果顯示細胞凋亡在肺纖維化的發生發展中起重要作用，內質網應激是新近研究發現的除線粒體凋亡通路和死亡受體通路兩大經典細胞凋亡途徑之外的又一細胞凋亡途徑[3]。本研究對大鼠肺泡巨噬細胞進行體外培養，并觀察內質網應激特異性誘導劑毒胡蘿卜素（TG）對AM增殖和凋亡的影響，初步探討內質網應激對AM凋亡的影響.

1資料與方法

1.1一般資料 SD大鼠由安徽醫科大學實驗動物中心提供，毒胡蘿卜素TG購自Sigma公司，胎牛血清購自杭州四季青生物公司，DMEM培養基購自Gibco公司，MTT試劑盒購自南京凱基生物公司， AnnexinⅤ-FITC/PI測凋亡試劑盒購自BestBio公司。

1.2方法

1.2.1大鼠AM的分離純化 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定于手術板上，常規消毒分離氣管，用小手術剪剪一V型切口，經氣管插管用37℃生理鹽水行支氣管肺泡灌洗4～5次，5ml/次，回收液集中于無菌試管中，經雙層紗布過濾后移至無菌離心管中，離心（4 ℃，1500 r/min×10 min），PBS液漂洗沉淀后，用含10%小牛血清的DMEM培養液1 ml重懸沉淀，接種于培養皿中。經37℃、5%CO2細胞培養箱內孵育2 h。棄培養液，用PBS洗去除未貼壁細胞，貼壁細胞則為純化AM[4]。

1.2.2 MTT法測細胞存活率 在96孔板內加入200μL的細胞懸液，調整每孔細胞數為4000，在37℃、5%CO2細胞培養箱內培養24h后，棄上清，每組加入含有不同濃度TG（1μM，2μM，4μM，8 μM）的等體積培養液200μL，對照組加入等體積培養液，每組設5個復孔。在37℃、5%CO2細胞培養箱內繼續培養24h后，每孔加50μL 1×MTT。4h后終止培養，棄上清，每孔加入150μL的DMSO，充分混勻，使結晶充分溶解，酶標儀在490nm 波長處檢測每孔的光密度OD 值，實驗重復3 次。計算細胞存活率，細胞存活率% =（TG 干預組OD/對照組OD）×100%。

1.2.3用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染，流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況 在六孔板內加入細胞懸液，調整濃度至1×106/ml，在37℃、5%CO2細胞培養箱內培養2h貼壁后，每組分別加入不同濃度的TG（1μM，2μM，4μM，8μM） 對照組加入等體積培養液，培養箱內培養24h后，終止培養。收集上清和胰酶消化下來的貼壁細胞，2 000 r/min，5min離心后制成單細胞懸液，冷PBS洗滌細胞兩次。然后加入400μL1×Binding Buffer重懸細胞沉淀并移入流式管內，先加入5μL AnnexinV-F1TC染色液，輕輕混勻后于2℃～8℃避光條件下孵育15 min，再加入10μL PI染液，同等條件下孵育5min，在波長488 nm下，1 h內上機檢測細胞凋亡，并用WinMDI 2.9分析軟件行凋亡率測定，實驗重復3次.

1.2.4熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態 滴一滴經過AnnexinⅤ-FITC/PI雙染（操作步驟同上）的細胞懸液于載玻片上，用蓋玻片蓋上。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察，Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

2結果

2.1 TG對肺泡巨噬細胞存活率的影響 與對照組比較，不同濃度的TG（1μM，2μM，4μM，8μM）作用于AM24h后，細胞存活率明顯下降，（#P<0.05），并具有濃度依賴性（見圖1） 。

2.2 TG對肺泡巨噬細胞凋亡率的影響 經過AnnexinⅤ-FITC/PI雙染的細胞，在流式細胞儀檢測細胞的凋亡，分布于流式細胞圖左下象限（LL）的是正常細胞，分布于右下象限（LR）的是早期凋亡細胞，分布于右上象限（UR）的是晚期凋亡或壞死細胞。早晚期細胞凋亡百分數總和稱為總凋亡率。見圖2，細胞凋亡檢測結果顯示對照組總凋亡率（3.89+3.57）%，TG（1μM，2μM，4μM，8μM）各組總凋亡率分別為（8.01+3.61）%，（10.28+5.08）%，（14.98+4.84）%，（15.60+5.88）%，與對照組比較，均具有明顯增高，（ #P<0.05），且具有濃度依賴性。

2.3熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態 見圖3，整個細胞呈綠色熒光的是早期凋亡細胞，細胞內被染成紅色的是晚期凋亡細胞或壞死細胞.與對照組比較，不同TG濃度組（1μM，2μM，4μM，8μM）的細胞凋亡數量明顯增加，且各組之間也有顯著差異。

死亡受體活化和線粒體損傷是兩條經典的介導細胞凋亡信號傳導通路，除了這兩條經典的凋亡途徑外，近來研究發現過度內質網應激可啟動細胞凋亡，是一條新的細胞凋亡信號傳導通路，這一信號傳導通路包括非折疊蛋白反應和鈣離子起始信號等機制[5]。TG的作用位點是抑制內質網膜Ca2+- ATP 酶抑制劑，誘導胞漿內Ca2+濃度上升和內質網儲存鈣的下降從而引起內質網應激，誘導凋亡，而與線粒體途徑和死亡受體途徑無關，因此被廣泛認為是內質網應激特異性的誘導劑[6]。

近年來，有許多研究發現內質網應激與肺間質纖維化的發生相關，內質網應激通路或許可以作為治療肺纖維化的靶點，AM做為肺纖維化發病早期的炎癥始動細胞，其增殖凋亡情況關系到肺間質纖維化病情的發展。本研究推測內質網應激與AM的增殖凋亡有關，用不同濃度的內質網應激特異性誘導劑TG作用于AM，通過檢測TG對AM存活率和凋亡情況的影響，初步驗證內質網應激是否介導MA的凋亡。結果顯示，隨著TG 濃度的增加，AM的存活率逐漸降低，明顯低于對照組，流式細胞儀檢測，隨著TG 濃度的增加，AM的凋亡率逐漸增高，明顯高于對照組，在熒光顯微鏡下觀察有典型的細胞凋亡形態改變。提示TG具有抑制AM增殖，誘導AM凋亡的作用，初步分析內質網應激與AM增殖凋亡的相關關系，為治療肺纖維化提供新的科學依據。

參考文獻：

[1]Lentsch A B，Czermak B J ，Bless N M，et al. Essential role of alveolar macrophages in intrapulmonary activation of NF-kappaB [J].Am J Respir Cell Mol Biol， 1999：20 （4） ： 692-698.

[2]何燕，鄧國忠，高天.肺纖維化細胞因子機制研究進展[J].中華創傷雜志，2006，22（6）：477-480.

[3] Ferri K F，Kroemer G.Organelle-specific initiation of cell deathpathways[J].Nat Cell Biol，2001，3（11）：255-263.

[4] Huang Y， Li J， Cao Q et al. Anti-oxidative effect of triterpene acids of Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl. leaf in chronic bronchitis rats [J]. Life Sci，2006，78（23）： 2749-2757.

[5]林麗， 唐朝樞， 袁文俊. 內質網應激[J]. 生理科學進展2003；34 （4 ）：333-335.

[6]何白梅，羅百靈，袁浩.毒胡蘿卜素誘導A549 細胞凋亡的實驗研究[J].現代生物醫學進展，2010，10（1）：23-25.

編輯/許言