負載HER—2的樹突狀細胞誘導T細胞對骨肉瘤殺傷活性的研究

摘要：目的 研究用HER-2抗原負載樹突狀細胞誘導T淋巴細胞對骨肉瘤細胞系U2-OS的殺傷活性。方法 用HER-2抗原肽段E75369-377（HER-2組）、PBS（PBS組）分別負載PBMC來源的樹突狀細胞，與T淋巴細胞共培養7d后檢測各組T細胞穿孔素的表達，通過LDH釋放法比較兩組T細胞對U2-OS的殺傷活性。結果 HER-2組的T細胞表達穿孔素高于PBS組（P<0.01）；HER-2組的T細胞對U2-OS的殺傷率高于PBS組（P<0.01）。結論 用HER-2抗原肽E75369-377負載樹突狀細胞誘導T細胞能提高對骨肉瘤細胞系U2-OS的殺傷效率。

關鍵詞：樹突狀細胞；HER-2；骨肉瘤；免疫治療

負載腫瘤抗原的樹突狀細胞可以誘導T淋巴細胞對腫瘤細胞產生特異性殺傷免疫效應[1]，據此我們用人類表皮生長因子受體2（HER-2）負載人樹突狀細胞誘導同源的T淋巴細胞，觀察其對人骨肉瘤細胞系U2-OS的殺傷活性。

1資料與方法

1.1 一般資料 骨肉瘤細胞株U2-OS購自中國科學院上海細胞庫；HER2（E75369-377）肽段購自上海強耀生物科技有限公司；rhGM-CSF、IL-4和TNF-a購于PeproTech公司；重組人白細胞介素-2（rhIL-2）購于北京雙鷺藥業股份有限公司；Anti-Human HLA-DR APC購于美國BD公司；Anti-Perforin antibodies human PE購于德國Miltenyi公司；Cell Permeabilization Kit購于ADG公司；CytoTox96？非放射性細胞毒性檢測試劑盒購于美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 DC的分離、培養、及鑒定 從健康成人中篩選出5名HLA-A2表型陽性的志愿者，抽取外周血10ml，用Ficoll密度梯度離心法[2]提取外周血單個核細胞（PBMC），細胞計數平均在5×107～7×107個；用貼壁法分離出單核細胞，懸浮的淋巴細胞凍存備用。單核細胞用含800U/ml GM-CSF和500U/ml IL-4的1640培養基培養，添加15%的無支原體胎牛血清（FBS），誘導其向樹突狀細胞（DC）分化。培養第5d時加TNF-α100ng/ml刺激DC成熟。培養至第7d收集細胞105個，用流式抗體APC-HLA-DR標記，同時設置陰性對照，在流式細胞儀上檢測成熟DC表面分子標記。

1.2.2用HER-2抗原負載DC 收集成熟DC，取1×106個細胞，離心后用2ml含GM-CSF和IL-4的1640培養基重懸，細胞懸液等分為2份，轉移到2支5ml EP管中，分別加HER-2抗原肽E75369-377 （2mg/ml） 20ul（HER-2組）、PBS 20ul（PBS組），搖勻后在37℃、5%CO2培養箱中孵育4h，期間每30min搖勻一次。然后加PBS3ml離心，用淋巴細胞培養基2ml重懸。

1.2.3誘導抗原特異性T細胞 提前1d復蘇同源的淋巴細胞，用1640培養基（添加15%的FBS）在37℃、5%CO2培養箱中培養一天，觀察細胞狀態。取1×107個淋巴細胞，按DC：T為1：10的比例分別與HER-2組和PBS組的DC懸液混合，同時加入細胞因子IL-2（500U/ml）。在37℃、5%CO2培養箱中共培養7d誘導抗原特異性T細胞，每2天補液1ml，并相應添加IL-2。

1.2.4檢測T細胞穿孔素的表達 收集HER-2組和PBS組經DC誘導的T細胞，每組取106個細胞到流式分析管中，用PBS 3ml洗一遍后加100ul固定液，混勻后室溫避光孵育15min；然后加3ml的PBS洗一遍，棄盡上清；然后加入100ul破膜劑，再加流式抗體Anti-Perforin PE 5ul，混勻后避光室溫孵育15min；加3ml PBS洗一遍，然后棄盡上清；用100ul PBS重懸細胞，在流式細胞儀上檢測T細胞穿孔素的表達。

1.2.5乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗檢測T細胞對骨肉瘤細胞的殺傷率 用CytoTox 96R非放射性細胞毒性檢測試劑盒，按照說明書操作。收集HER-2組和PBS組經誘導的T細胞作為效應細胞；取對數期生長的U2-OS細胞，調整密度為1.0×105/ml；將T細胞與骨肉瘤細胞U2-OS按40：1、20：1、10：1的比例分別加入96孔板中，每組設3個復孔，同時設T細胞自然釋放孔、U2-OS細胞自然釋放孔、U2-OS細胞最大釋放孔，在37℃、5%C02培養箱里共孵育6h，酶標儀測定波長490nm的吸光度。按以下公式計算殺傷率，殺傷率（%）=（E-S1-S2）/（M-S1）×100%，其中E=實驗孔OD均值，S1=U2-OS細胞自然釋放孔OD均值，S2=T細胞自然釋放孔OD均值，M=U2-OS細胞最大釋放孔OD均值。

1.2.6 統計處理 用SPSS 16.0軟件分析，結果以（x±s）表示，采用t檢驗，檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 鑒定DC的成熟 在倒置顯微鏡下觀察貼壁的單核細胞在細胞因子rhGM-CSF、IL-4和TNF-α作用下細胞體積逐漸變大，形態不規則，大量毛刺樣突起形成；培養7d時細胞大多懸浮生長，具備成熟DC的形態學特點。用流式抗體APC-HLA-DR標記細胞，測得HLA-DR的表達率達77%。

2.2 檢測T細胞穿孔素的表達 倒置顯微鏡下觀察共培養的DC和T細胞，發現T細胞增殖活躍。用流式細胞儀檢測HER-2組和PBS組經DC誘導7d的T細胞穿孔素的表達率（見圖1），分別為（50.70±4.55）%、（23.70±3.49）%；經兩樣本均數t檢驗，兩組間殺傷率的差異有統計學意義（P<0.01），HER-2組誘導的T細胞穿孔素表達率高于對照組。

圖1 各組抗原特異性CTL穿孔素的表達

2.3 LDH釋放法檢測檢測T細胞對骨肉瘤細胞的殺傷率 HER-2組和PBS組在不同的效靶比下對人骨肉瘤細胞系U2-OS的殺傷率見表1。隨著效靶比的提高，兩組誘導的T細胞對U2-OS細胞的殺傷率相應提高，在T細胞：U2OS細胞的比例為40：1時測得殺傷率最高。HER-2組與PBS組比較差異有統計學意義（P<0.01）。

3討論

骨肉瘤惡性程度極高，已發生早期轉移，目前臨床治療方法有限，術后患者復發率高[3]。近年來腫瘤免疫治療進展迅速，其具有特異性強、毒副作用小等優點，為治療骨肉瘤提供了新方法。抗腫瘤免疫中細胞免疫起主要作用，其中主要是CD8+T細胞的特異性殺傷作用，它需要抗原呈遞細胞先遞呈腫瘤抗原方能識別腫瘤細胞。DC是體內功能最強大的抗原呈遞細胞，是目前研究的熱點[1]，它可將腫瘤抗原有效呈遞T細胞，使其活化產生對腫瘤細胞的特異性殺傷效應。

HER-2在多種人類腫瘤中過度表達，它在幾乎所有骨肉瘤細胞系包括U2-OS中均表達陽性[4]，目前它在乳腺癌患者中研究較多[5]，是有效的治療靶點。孟東[6]等用負載HER-2多肽的DC在體內、外均能夠誘導特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）免疫反應。因此HER-2可以作為一種理想的腫瘤抗原用來制備骨肉瘤治療性疫苗。E75369-377是人工合成的HER-2抗原表位肽，本實驗用E75369-377負載DC誘導同源的T細胞，觀察其對人骨肉瘤細胞系U2-OS的殺傷活性。

穿孔素是特異性存在于 CTL胞質細胞毒顆粒中的糖蛋白，是其殺傷腫瘤細胞的主要效應分子[7]，通過檢測穿孔素的表達率可以反應出DC誘導T細胞活化為CTL能力的強弱。本研究發現用HER-2抗原負載DC能夠有效誘導T細胞活化使其成為CTL；通過細胞毒殺傷實驗LDH釋放法發現負載HER-2抗原的DC誘導T細胞活化對人骨肉瘤細胞系U2-OS殺傷效率明顯提高，而且隨著T細胞的增多殺傷率隨之升高。表明用HER-2抗原負載DC誘導T細胞活化，可以顯著提高對骨肉瘤細胞的殺傷效應，這為進一步研究提供了實驗依據。

參考文獻：

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[3]Fagioli F，Biasin E，Mereuta OM et al.Poor prognosis osteosarcoma： new therapeutic approach[J].Bone Marrow Transplant，2008，41 Suppl 2：S131-S134.

[4]Ahmed N，Salsman VS，Yvon E et al.Immunotherapy for osteosarcoma： genetic modification of T cells overcomes low levels of tumor antigen expression[J].Mol Ther，2009，17（10）：1779-1787.

[5]Arteaga CL，Sliwkowski MX，Osborne CK et al.Treatment of HER2-positive breast cancer： current status and future perspectives[J].Nat Rev Clin Oncol，2012，9（1）：16-32

[6]孟東，時偉鋒，孫春雷，等.負載HER-2/neu多肽的樹突狀細胞激發特異性CTL反應[J].中國腫瘤生物治療雜志，2012，19（01）：29-34.

[7]McCormack R，de Armas L，Shiratsuchi M et al.Killing machines： three pore-forming proteins of the immune system[J].Immunol Res，2013，57（1-3）：268-278.

編輯/申磊