手足口病病原的熒光PCR法檢測及其臨床特點

摘要：目的 探究手足口病病原的PCR檢測方法及臨床特點。方法 選取我市2012年1月～2013年1月確診為手足口病的患兒40例作為研究對象，取其血液40例及大便標本40例。應用熒光PCR檢測法分別對標本中腸道病毒篩選、柯薩奇病毒中A組16型（CVA16）、腸道71型病毒（EV71）進行鑒別，并歸納分析其臨床表現。結果 40例大便標本檢測顯示，8例CVA16陽性，10例EV71陽性，20例EV-COM陽性。CVA16及EV71陽性的患兒在熱程、體溫、住院時間、尿素氮、血肌酐、AST、ALT比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論 對疑似者發病早期的大便使用熒光PCR檢測，可及時診斷出病原。

關鍵詞：手足口病；熒光檢測；臨床特點

手足口病（HFMD）是學齡前兒童中常見的一種急性傳染性疾病，屬于我國法定的報告管理型丙類傳染病。病情嚴重者會導致腦炎、神經源肺水腫、無菌性腦膜炎、心肌炎和急性遲緩麻痹等。手足口病的主要致病病毒是腸道71型病毒（EV71）和柯薩奇病毒中A組16型（CVA16）。部分患者在感染手足口病病毒后，病情進展迅速，患者的死亡速度快[1]。筆者特于2012年1月～2013年1月選取我市收集的80例血液、大便樣本，應用PCR檢測技術進行研究，取得較好的成效，現將結果報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料 選取我市2012年1月～2013年1月收入確診為HFMD的患兒40例作為研究對象，取其血液及大便標本共80例。手足口病的診斷參照我國衛生部2011年修訂的手足口病的預防控制指南[2]。年齡1.1～13.1歲，平均（4.5±1.1），發病至入院時間0.6～8.1d，平均（4.1±0.7）d。其中，發熱者40例，口腔潰瘍者38例，手部皮疹者40例，足部皮疹者39例，臀部皮疹者13例。

1.2儀器、試劑和檢測方法

1.2.1主要儀器及試劑 選擇SLAN實時熒光定量PCR檢測儀器、離心機、金屬浴等。使用由江蘇碩世生物科技有限公司提供的腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）、柯薩奇病毒A16型核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。

1.2.2操作方法 所有患兒均在入院當日抽取4ml靜脈血和10g大便標本，靜脈血置放在無菌真空管中，分離血清后，大便滅菌后置入密閉盒中，兩組標本均于零下20℃儲存備用。對血清及大便標本進行RNA提取及擴增或，由經培訓的專業人員嚴格按照相關試劑及儀器的使用說明書進行操作。

1.3觀察指標 對患兒入院及出院時的肌紅蛋白、腎功能、肌鈣蛋白、肝功能及血常規等進行檢測。

1.4統計學處理 數據的收集與處理均由我單位數據處理中心專門人員進行，保證數據真實性與科學性。初步數據錄入EXCEL（2003版）進行邏輯校對與分析，得出清潔數據采用四方表格法進行統計學分析，分析結果以P<0.05表示有統計學意義。

2結果

2.1血清標本檢驗結果 本組患兒PCR檢測結果顯示，40例血清標本中，未檢出陽性病例。

2.2大便標本檢驗結果 40例大便標本PCR檢測結果顯示，CVA16陽性者8例，EV71陽性者10例，EV-COM陽性者20例。EV-COM陽性患兒大便標本的采集時間為發病4.2d左右，前3d采集標本中的陽性病例比例為80%；EV-COM陰性患兒大便標本的采集時間為發病6.2d左右，EV-COM陽性及陰性標本采集時間比較，差異具有統計學意義（t=2.2164，P=0.0384）。

2.3不同病原的致病患兒相關指標分析，見表1。

2.4不同病原的致病患兒相關指標分析，見表2。

3討論

HFMD是常見的一種腸道疾病，容易在兒童中感染發展為重癥，引起患兒死亡。其常見的病原有埃可病毒、柯薩奇病毒及EV71。傳統檢測HFMD病毒的方法是組織培養分離，但該方式具有一定程度的局限性，不適用于臨床的常規檢測[2]。

通過對40例患兒研究中的臨床表現看，手足臀皮疹、發熱和口腔潰瘍仍然是HFMD的癥狀特征。研究中40例患兒血清中未檢出陽性病毒，這可能與病毒血癥的持續時間短或患兒血液內病毒水平較低相關；大便標本中的陽性病毒檢出率達50%，與皰疹液和咽拭子中的檢出率相近（60%）[3]。在20例通用型試劑盒的陽性檢測中，CVA16及EV71陽性陽性感染分別為8例和10例，表明CVA16及EV71是HFMD的主要病原體，其它病毒的感染相對少見，如埃可病毒等。同時也說明，通用型試劑盒在HFMD病院的檢測診斷中具有顯著的實用性，可應用在病原學的篩查中[4]。研究中對CVA16及EV71感染患者進行對比后發現，兩組患者的臨床癥狀基本相同，其嚴重程度也無大的區別，本研究中的EV71病毒感染者均未出現心肌炎、腦膜炎等嚴重疾病，可能與患兒間個體間差異、病毒變異或病毒血癥持續時間較短相關，其具體原因還有待進一步的研究確定[5]。在患病過程中應對EV71型病原感染者著重護理，避免患兒出現嚴重的腦、心、肺等并發癥。相關研究顯示[6]，在發病早期對患者大便進行檢測，可提高病原學檢出率。研究中所有樣本均在患者入院當天采集，檢出率高可能與該樣本采集時間較早相關；同時研究所用試劑盒可在單支管中同時對腸道病毒、CA16及EV71型病毒進行檢測，且能準確對CA16及EV71型病毒進行區分鑒別，其他相關RT-PCR檢測時一般為單支管單純檢測一個目的基因，其可能對檢測過程及其靈敏度產生影響[7]。通用型腸道病毒檢測在HFMD的病原學檢測和診斷中有重要的意義及實用價值，可應用于其病原學的篩查中。相關學者研究后指出[8]，皰疹液及咽拭子在經病毒分離后的檢出率較高，臨床檢測時結合皰疹液、咽拭子，可明顯提高HFMD病原學診斷的成功率。為后期HFMD的病原學檢測提供了新途徑。

綜上所述，HFMD是常見腸道疾病，其臨床常見表現為手足臀皮疹、發熱和口腔潰瘍。臨床中對HFMD的病原檢測可使用熒光PCR法，該方式應用于早期檢測，可及時準確地診斷出其病原，值得進一步推廣及應用。

參考文獻：

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