乙肝寧顆粒抗乙型肝炎病毒的體外實驗研究

摘要：目的 探討體外乙肝寧顆粒抗乙肝病毒活性。方法 將不同濃度乙肝寧顆粒與HepG⒉⒉15細胞株共培養9d，以拉米夫定為陽性對照藥，以MTT比色法觀察藥物細胞毒性；用ELIS法測定細胞上清液中乙型肝炎病毒e抗原（ HBeAg），乙型肝炎病毒s抗原（ HBsAg）；采用熒光定量PCR法（FQ-PCR） 測定細胞上清液HBV DNA，計算抑制率。結果 乙肝寧顆粒在體外能有效抑制HepG⒉⒉15細胞分泌HBsAg和HBeAg，最大抑制率分別為54.69%和25.93%；對HBV DNA的復制有一定抑制作用（P<0.05）。結論 乙肝寧顆粒能有效抑制HepG⒉⒉15細胞中HBV復制，說明在體外具有顯著的抗乙型肝炎病毒作用，且毒性較小，具有良好應用前景。

關鍵詞：乙肝寧顆粒；HepG⒉⒉15細胞；乙型肝炎病毒

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝臟炎性病變為主，并可引起多器官損害的一種疾病，也是我國當前流行最為廣泛、危害性最嚴重的一種疾病。中醫藥是我國的特色和寶庫，在治療病毒性肝炎方面發現了不少有效的單方和復方制劑。

乙肝寧顆粒是基于理論研究和臨床觀察，將黃芪、黨參、白花蛇舌草、綿茵陳等13味中藥按君、臣、佐、使進行配伍而制成的復方顆粒劑。具有補氣健脾，活血化瘀，清熱解毒的功效，用于慢性乙型肝炎[1]。文獻報道[2-8]臨床上應用乙肝寧顆粒治療慢性乙肝療效較好。伍一文[9]等對其保肝、降酶、抗鴨乙肝病毒及免疫功能等作用進行了實驗研究。為探討乙肝寧顆粒抗乙肝病毒作用，本文用HepG⒉⒉15細胞株為模型，考察了用藥后細胞培養上清液中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、E抗原（HBeAg）的改變，并采用熒光定量PCR法考察其對HBV DNA的抑制效果，評價其抗HBV活性。

1 材料

⒈1試藥 HepG⒉⒉15細胞株 （購自上海細胞所），乙肝寧顆粒（九芝堂股份有限公司，購于東方大藥房，批號130124），拉米夫定（3TC，葛蘭素史克制藥有限公司，批號13020027），HBeAg診斷試劑盒（批號201304035）和HBsAg診斷試劑盒（批號201307009）（上海華泰生物工程公司）、HBVDNA熒光定量PCR檢測試劑盒 （批號20130617）（上海科華生物工程股份有限公司）。四甲基偶氮唑鹽（Sigma USA），MEM培養基粉、丙酮酸鈉、胎牛血清（上海韻涵生物科技有限公司）、G418（Gibco，USA），Tryple express（Invitrogen，USA），

⒈2儀器 熒光定量PCR儀（ABl7500，ABI，USA），CO2恒溫培養箱（Thermo Fisher，USA），-80℃冰箱，酶標儀，倒置顯微鏡（德國Leica公司），生物安全柜（上海振梓創空氣凈化設備有限公司）。

2 方法

⒉1細胞模型[10] HepG⒉⒉15細胞株（購自上海細胞所），細胞用MEM培養液（含10%胎牛血清，500 mg·L-1G418），置37℃，5%CO2恒溫培養箱中培養，隔3d換液，6d傳代1次。待HBV DNA表達穩定后開始實驗。

2.2乙肝寧顆粒溶液與3TC溶液的配制 將乙肝寧顆粒研細，準確稱取乙肝寧顆粒粉末，3TC適量，溶解于無菌雙蒸水中，按每次用量分裝成若干份，保存于-20℃冰箱中，用時取出一份，用含2%胎牛血清，500mg·L-1 G418的培養基稀釋制備成質量濃度分別為25mg·L-1，50mg·L-1，100mg·L-1，200mg·L-1，400mg·L-1的乙肝寧顆粒溶液，以及質量濃度分別為100mg·L-1，10mg·L-1，1mg·L-1，0.1 mg·L-1，0.01mg·L-13TC的溶液。

⒉3藥物細胞毒性實驗 參照Mosmann建立的四甲基偶氮唑鹽法（MTT）[11]，檢測藥物對HepG⒉⒉15細胞生長的抑制作用。具體方法為HepG2.2.15細胞1瓶，用胰酶消化后制備成單細胞懸液，計數后調整細胞濃度至3.0×106cells·mL-1。加入96孔培養板中，每孔100μL。培養板置于細胞培養箱中，37℃、5%CO2培養過夜待貼壁。吸去上清后分別加入乙肝寧顆粒供試品溶液和3TC溶液的DMEM培養基（含10%胎牛血清，pH 7.2），每孔100皿，每個濃度3復孔。同時設不加藥物的細胞對照組。同條件下繼續培養，每天收取上清液（-80℃冰箱保存）并更換原濃度新鮮藥液，共加藥培養9d。9d后，采用MTT法，測定570nm的吸光度（A），觀察藥物對細胞的毒性。實驗重復3次，計算細胞存活率，按Reed-Meuench法[12]計算半數有毒濃度Tc50和最大無毒濃度TC0。TC50即細胞存活率為50%時的藥物濃度；一般認為在藥物作用下若細胞存活率>95%，此藥物濃度即為TC0，對培養細胞無毒性，為藥物作用的安全無毒性[13]。公式如下：細胞存活率%A570（樣品）/A570（對照）×100%

TC50Anti log[logB+（50-B）的抑制百分率/（A-B）的抑制百分率×C]×100%

其中A570（樣品）為加入乙肝寧顆粒供試品或3TC后的細胞吸光度，A570 （對照）為空白對照的細胞吸光度，A≥抑制50%藥物濃度，B≤抑制50%藥物濃度，C=log稀釋倍數。

⒉4藥物抗HBV實驗 HepG⒉⒉15細胞用胰酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞濃度至3.0×104cells·mL-1加入到96孔細胞培養板中，每孔1mL，37℃、飽和濕度，5%CO2培養過夜，于48h后換入不同濃度的乙肝寧顆粒和3TC的DMEM混合培養液培養9d，9d后將細胞消化凍存于液氮罐中。實驗同時設3孔無藥物細胞對照，并重復3次。第9d收集各孔上清液至1.5 mL離心管中-20℃凍存，待檢測HBsAg、HBeAg的水平和HBV DNA的含量。

⒉5HBsAg，HBeAg的檢測 采用ELISA法檢測上清液中HBsAg，HBeAg，實驗操作按試劑盒說明書執行。每個樣品平行3次，實驗重復3次。結果按下列公式計算抑制率。抑制率%=（A對照組-A用藥組）/A對照組×100%

⒉6 HBV DNA的檢測 采用FQ-PCR法檢測上清液中細胞外和細胞內HBV DNA的含量，實驗操作按試劑盒說明書進行。每個樣品平行3次，實驗重復3次，結果取平均值。結果按下式計算抑制率：抑制率=（對照組HBV DNA量-用藥組HBV DNA量）/對照組HBV DNA量×100%

⒉7藥物效果評價 藥物抗HBV活性用選擇指數（Selectivity Index，SI）進行評價[14]。SI=TC50/IC50。IC50（半數有效濃度）表示抑制率為50%時的藥物濃度。當SI>2時，表明藥物有效低毒；當1≤SI≤2時，提示藥物低效低毒；當SI<1時，則表明藥物為毒性作用。SI值越大，表示藥物對HBV的抑制作用越強，細胞毒性越小。

⒉8統計學處理 結果以（x±s）表示。采用SPSS13.0軟件進行方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

⒊1乙肝寧顆粒和3TC對HepG⒉⒉15細胞毒性作用 不同濃度的乙肝寧顆粒和3TC對HepG⒉⒉15細胞的毒性作用見表1。

從表1中可以看出，乙肝寧顆粒在200mg·L-1濃度下，細胞存活率>95%，即TC0=200mg·L-1，可認為乙肝寧顆粒在此濃度下對HepG⒉⒉15細胞基本無毒性，而3TC只有在0.01mg·L-1濃度下細胞存活率>95%。同時可以知道，乙肝寧顆粒在400mg·L-1 濃度下，3TC在100mg·L-1濃度下對細胞活力的抑制作用均小于10%，說明在此濃度下，乙肝寧顆粒和3TC均無明顯細胞毒性，可用于觀察藥物對細胞中HBV復制的抑制作用。

⒊2乙肝寧顆粒和3TC對Hep G⒉⒉15細胞分泌HBsAg，HBeAg的影響 根據藥物細胞毒性實驗確定了藥物濃度范圍。選擇1，3，5，7，9 d加藥后收集的細胞上清液作為樣品，用ELISA法檢測其中HBsAg，HBeAg分泌情況（見表2～5）。

由結果可知，不同濃度的乙肝寧顆粒溶液與3TC溶液對HepG⒉⒉5細胞分泌HBeAg，HBsAg均有抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，其抑制率也逐漸增加。在同一濃度下，乙肝寧顆粒對HBeAg的抑制作用均強于HBsAg，作用9d后，質量濃度為400mg·L-1乙肝寧顆粒溶液對HBeAg，HBsAg的抑制率分別為25.93%和45.44%，而質量濃度為100 mg·L-13TC溶液對HBeAg，HBsAg的抑制率分別為25.93%和19.86%，說明乙肝寧顆粒對HepG⒉⒉5細胞分泌HBeAg，HBsAg的抑制作用強于3TC。

⒊3乙肝寧顆粒和3TC對HBV DNA的抑制效果 選擇最后一次得到的上清液和藥物處理的細胞作為樣品，通過實時定量PCR檢測細胞上清液中病毒載量， 考察乙肝寧顆粒和3TC對HBV DNA的抑制效果（見表6）。

由結果可知，乙肝寧顆粒對HepG⒉⒉5細胞分泌的HBV DNA有較為顯著的抑制作用，隨著藥物濃度增加，其抑制作用亦增強，除藥物濃度為25mg·L-1的乙肝寧顆粒組外，其余組別與細胞對照組比較P<0.05，差異有顯著性。乙肝寧顆粒對HBV DNA抑制效果弱于3TC，但兩者相比較無統計學意義。

3.4藥物效果評價結果 乙肝寧顆粒對HBeAg 的SI為>20，對HBsAg 的SI為>24，表明乙肝寧顆粒能夠顯著抑制對HepG⒉⒉5細胞分泌HBeAg，HbsAg，具有較強的體外抑制HepG⒉⒉5細胞表達HBV抗原的作用，提示乙肝寧顆粒在體外實驗中有抑制HBV的作用。

4 討論

乙型肝炎是一個世界性的公共衛生問題。中國每年約有35萬人死于慢性乙肝相關的疾病[15-16]。目前治療乙型肝炎主要采用抗病毒治療，其藥物主要包括干擾素和核苷類似物兩類，亦取得了一定療效。但由于其毒副作用導致應用受到較大的限制，因此積極開發安全有效，毒副作用小，療程短，費用低的抗HBV藥是目前亟待解決的問題，而中醫藥是我國的特色和優勢，對治療慢性乙型肝炎積累了一定的經驗，發現了不少有效的單方或者是復方，為篩選理想的抗HBV藥物提供了思路和希望。

本實驗采用HepG⒉⒉15細胞株體外培養方法，觀察受試藥物對乙型肝炎病毒的HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用以及對病毒核酸的抑制作用。HepG⒉⒉15細胞是帶有G418抗性基因片段與含HBV DN重組質粒轉染人肝癌細胞系（ HepG2）的2.2.15細胞系，能在體外長期培養，穩定、高水平地分泌HBV顆粒（ Dane顆粒）、HBsAg，HBeAg以及 HBVDNA，并能產生大量復制中間體，再現 HBV 在肝細胞中的復制和表達[17]。用該細胞系進行抗HBV藥物篩選，結果可以比較準確地預測藥物在人體內的作用，是目前國內外公認和常用的體外評價HBV藥物的細胞模型，現已成為申報抗新藥必須做的體外實驗模型[18-21]。

實驗中以拉米夫定（3TC）為陽性實驗對照藥物，是目前治療病毒性肝炎的常用藥物[22-23]。其主要作用機制是進入細胞內后磷酸化成拉米夫定三磷酸鹽（L-TP），與脫氧胞苷三磷酸（dCTP）競爭結合位點，抑制HBV逆轉錄酶的活性，阻斷合成新HBV DNA的鏈化，達到抑制HBV復制的目的[24]。但存在治療乙肝時用時長，易產生耐藥性，毒副作用大，停藥后易反彈等問題。實驗結果表明，3TC抗HBV病毒的效果雖然優于乙肝寧顆粒，但其細胞毒性亦比乙肝寧顆粒強得多。乙肝寧顆粒由黃芪、白花蛇舌草、茵陳、首烏、丹參、茯苓、白芍、黨參等組成。黃芪補氣升陽、利水消腫；白花蛇舌草清熱解毒，利濕；茵陳清熱利濕、退黃；金錢草清利濕熱，利水通淋，除濕退黃；首烏養血滋陰、解毒通便；黨參健脾益肺、養血生津；白芍平肝柔肝、緩急止痛；茯苓利水滲濕、健脾和胃；丹參活血祛瘀、清心除煩。此方共成調氣健脾、滋養肝腎、利膽清熱、活血化瘀之法則，在抑制病毒復制的同時提高機體免疫力，降低藥物對機體的損傷，并可促進正常肝細胞的恢復與再生。

采用HepG⒉⒉15細胞株體外培養方法，實驗條件易于控制、研究結果均衡性較好。但離體體外實驗不能完全反映體內所特有的免疫調節和藥物在體內的代謝情況。因此，此實驗研究雖顯示乙肝寧顆粒具有較好的對HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用以及對病毒核酸的抑制作用。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中國藥典，I部[M].北京：化工業出版社，2010：403-404.

[2]田夏元，喻長遠. 乙肝寧顆粒劑治療慢性乙型肝炎的臨床觀察[J]. 中成藥，1999，07：27-28.

[3]張立慧，倫志新，溫秀艷.乙肝寧顆粒劑治療慢性乙型肝炎120例臨床觀察[J]. 承德醫學院學報，1999，02：34.

[4]張健，宣世英，吳樹華，等.乙肝寧顆粒劑治療慢性乙型肝炎64例療效分析[J]. 湖南中醫雜志，1999，01：19.

[5]楊志賢，張國朝.乙肝寧顆粒劑治療慢性乙型肝炎48例[J]. 湖南中醫雜志，1999，02：15

[6]王聯生，陳新平，李翠香，等.乙肝寧顆粒劑聯合左旋咪唑涂布劑治療慢性乙型肝炎的療效觀察[J]. 傳染病藥學，1999，02：8-10.

[7]慢性肝病的良藥—乙肝寧顆粒劑[J]. 湖南醫學，2001，01：12.

[8]戴慶，何杰.乙肝寧顆粒劑治療慢性肝炎效果臨床觀察[J]. 傳染病藥學，2003，01：20-21.

[9]伍一文，張登科，喻長遠.乙肝寧顆粒對肝損傷動物模型的保肝降酶及免疫調節作用的研究[J]. 湖南中醫學院學報，2001，02：14-15.

[10]任衍菊，張玉萍，金敏，等.氧化苦參堿體外抗乙型肝炎病毒作用[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（14）：175-179.

[11]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods，1983，65（1-2）：55-63.

[12]唐民科，徐秋萍.益腦沖劑抗實驗性腦缺血損傷的機制研究[J].中藥藥理與臨床，1996，12（2）：29-31.

[13]蔣學英，張均田，石成璋.人參皂甙Rb1降低細胞內Ca2+作用的機制[J].藥學學報，1996，31（5）：321-325.

[14]湛孝東，王克霞，李朝品.蝸牛多糖體外抗乙型肝炎病毒作用研究[J].中國實驗方劑學雜志， 2008，14⑶：66-72.

[15]翁水旺，沈詩景.治療乙肝新藥物的研究進展與評價[J].海峽藥學，2010，22（12）：101-102.

[16]農朝贊，王麗.中醫藥抗乙肝病毒的研究進展[J].右江民族醫學院學報，2010，32⑸ ，769-770.

[17]Sells M A， Chen M L， Acs G， et al.Production of hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA，1987，84： 1005.

[18]Fu Xiao zhong，Jiang Sai hong，Li Chuan，et al.Design and synthesis of novel bis（L-amino acid） ester prodrugs of 9-[2-（phosphonomethoxy）ethyl] adenine （ PMEA ）with improved anti-HBV activity[J].Bioorg Med Chem Let， 2007，17：465.

[19]Zheng Zi rui，Li Jun yan，Jing Sund，et al.Inhibition of HBV replication by theophylline[J].Antiviral Res，2011，89：149.

[20]Jia Wei， Zhao Yan-fang， Li Rong-dong，et al.Synthesis and in-vitro anti-hepatitis-B virus activity of 6H-[1]benzothiopyrano[4，3-b] quinolin-10-ols[J].Arch Pharm Chem Life Sci，2009，342：507.

[21]Olbert P， Weber J， Hegele A， et al. Combining lithoclast and ultrasound power in one device for percutaneous nephrolithotomy：in vitro results of a novel and highly effective technology[J].J Urol，2003，61⑴：55-59.

[22]Julesl Dienstag，Eugener Schiff，Teresa L Wright，et al. Lamivudine as initial treatment for chronic hepatitis[J].N Engl J Med，1999，341⒄：1256.

[23]George K K Lau，Teerha Piratvisuth，Luo Kang Xian，et al. Peginterferon Alfa-2a，Lamivudine，and the Combination for HBeAg-Positive Chronic Hepatitis B[J].NEJM，2005，352：2682.

[24]倪若愚.抗乙型肝炎新藥-拉米夫定[J].中華肝臟雜志，1998，6：55.

編輯/王敏