微生物檢查方法驗證及其影響因素探討

摘要：目的 規范微生物檢查方法驗證工作，便于人們進行微生物限度和無菌檢查工作時參考。方法 微生物檢查法方法驗證工作錯綜復雜， 影響因素較多，如培養基、試驗步驟以及供試品的制備等。在方法驗證過程中， 探討上述因素對驗證結果的影響。結果 本文系統闡述了微生物限度和無菌檢查法驗證的內容和技術評價要求，對準確檢測藥品中微生物含量等指標有著非常重要的參考價值和指導意義。結論 微生物檢查法方法驗證工作較為復雜，闡述了多種供試品的制備途徑。

關鍵詞：微生物限度；無菌檢查；方法驗證；影響因素；微生物檢測

微生物學檢查方法包括微生物限度檢查法和無菌檢查法。微生物限度檢查法是檢查非規定滅菌制劑及原輔料受微生物污染程度，包括細菌、霉菌等菌種的數目及控制菌檢查。無菌檢查法是檢查藥典要求的無菌藥品、原輔料等是否無菌。如外用制劑須檢查和驗證銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌；若制劑含藥材原粉等， 還需檢查和驗證大腸菌群和（或） 沙門菌。通過不同給藥途徑，因此臨床給藥途徑在微生物限度檢查和方法驗證中有著舉足輕重的地位。

1 方法驗證的模式及影響因素

1.1 培養基的無菌檢查及菌株準備 使用時應仔細觀察培養基碟子， 檢查是否有微生物污染或干燥收縮。經過預培養的培養基按照相應測定的微生物， 選擇標準菌株（不超過5代） 試驗。控制菌還應設定對照組， 以檢測其專屬性。

1.2 微生物方法驗證的內容

1.2.1 細菌、霉菌、酵母菌計數方法的驗證內容 至少進行3次平行試驗， 分別計算每次各試驗菌的回收率。驗證菌株為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、枯草桿菌。驗證方法分試驗組、菌液組、稀釋劑對照組以及供試品對照組，方法如下：試驗組：采用平皿法計數時，每株試驗菌均制備2個平皿；也可采用薄膜過濾法計數。菌液組：應檢測添加的試驗菌數。稀釋劑對照組：檢查供試液制備時，微生物受污染程度，采用薄膜過濾法計算其菌數。供試品對照組：定量取供試液，采用薄膜過濾法計算其供試品本底菌數。無菌檢查可采用：①薄膜過濾法：采用微孔濾膜攔截細菌，去除可溶性成分。驗證重點：確定濾膜的適用性、沖洗方法以及沖洗液用量。②中和法：中和劑應對微生物無毒性，與抑菌性成分結合后的產物，也應對微生物無毒性。驗證重點：確定中和劑有效，并證明對污染微生物無毒性。

1.2.2 控制菌檢查法的驗證內容 控制菌檢查包括大腸菌群、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、銅綠假單胞菌和梭菌檢查。試驗菌株嚴格按照規定檢查的控制菌，選取相應的驗證菌株。方法如下：試驗組：按照相應控制菌檢查法進行檢查。采用薄膜過濾法時，添加試驗菌應選在最后一次沖洗液后， 過濾后方可注入培養基中。對照組：驗證該檢查方法的專屬性。

1.2.3 細菌、霉菌、酵母菌計數方法的驗證結果判斷指標 根據上述試驗結果，可計算供試品組的菌回收率、稀釋劑對照組的菌回收率。如果任意一次試驗中試驗組的菌回收率，低于70%，應采用培養基稀釋法、薄膜過濾法等方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。

1.2.4 控制菌方法驗證的結果判斷 按《中國藥典》2005年版規定，陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。如果試驗組檢出試驗菌，則按照相應方法進行控制菌檢查。如果試驗組未檢出，則需重新驗證。控制菌檢查還應設有專屬性試驗。驗證試驗及結果的判斷：①目標菌陽性對照管菌和供試品加目標菌管生長良好；②陰性對照管以及陰性菌對照必須無菌生長。如果上述試驗成立，表示可按照該方法進行該品種的控制菌檢查。

1.3 特殊供試品的制備 由于供試品本身的特性，可能會產生假陰性。在正常生產過程中，利用供試品與微生物的差異，消除供試品對藥品中微生物的影響，從而準確檢測藥品中微生物的真實含量，是較為普遍使用的方法。具體包括：①培養基稀釋法：取規定量供試品/供試液，加至培養基中，使單位體積內的供試品濃度稀釋至無明顯抑菌作用。適用范圍：不能使用薄膜過濾法，抑菌活性較弱的樣品。驗證重點：把握好培養基增加量與供試品/供試液不顯抑菌活性的關系。②離心沉淀法：利用沉降系數差異除去藥渣以及含抑菌活性的部分。適用范圍：不能采用薄膜過濾等方法的樣品。驗證重點：設置有效離心率，確定能將藥渣、抑菌部分除去。③薄膜過濾法：采用微孔濾膜攔截細菌，去除可溶性成分。④中和法：中和劑應對微生物無毒性，與抑菌性成分結合后的產物，也應對微生物無毒性。

2 微生物檢查方法驗證的難點問題

人們對藥品生產、保存和使用過程中，對于可能出現的微生物污染問題進行了大量的研究考察。很多研究資料表明[1，2]：藥品中污染的微生物數量以及微生物種類有不確定性，在藥品生產環節中， 微生物污染存在著隨機性。因此，為了監控藥品生產過程中的微生物污染。所有的藥品必須在安全性檢查后，才能應用于臨床。無論是無抑菌性藥物還是抑菌性藥物，都要進行微生物限度檢查， 特別是某些微生物在一定環境下可能受到損傷， 但當服用至人體后， 條件適宜時仍可生長繁殖，破壞人體健康。抑菌藥物內微生物能夠對人體健康造成危害的情況必須警惕， 因此必須對抑菌性藥物進行微生物限度檢查，但由于其本身的抑菌作用， 這嚴重影響了微生物的檢出。

3討論

藥品微生物限度檢查方法驗證工作是錯綜復雜的過程，控制不當很難達到驗證要求以及預想的試驗效果。嚴格按照操作規范操作， 盡量避免試驗過程中的誤差。

參考文獻：

[1]陳華龍，王莉蓓，譚莉萍.姜膽咳喘片微生物限度檢查方法的驗證[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（11） ： 67.

[2]熊青，李香斌，譚小輝.仙陽壯腎膠囊微生物限度檢查的方法學驗證[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（22） ： 86.

編輯/王海靜