腦膠質瘤中EDNRB基因甲基化狀態的研究

摘要：目的 本研究采用巢氏PCR（nMSP法）和亞硫酸氫鹽修飾后測序法（BSP法）方法，檢測手術切除腦膠質瘤組織中候選抑癌基因EDNRB基因啟動子區甲基化狀態，探討EDNRB基因啟動子的異常甲基化水平在腦膠質瘤發生發展中的作用以及與臨床病病理資料之間的關系。方法 選取經病理證實的20例腦膠質瘤患者，術前均未行放療和化療，收集切除的腫瘤組織。同時收集2例腦挫裂傷患者正常腦組織進行對照，應用nPCR方法和BSP方法檢測標本中EDNRB基因啟動子區CpG島的甲基化狀態。結果 正常腦組織未見甲基化，低級別（I-II級）膠質瘤中與高級別組（Ⅲ-IV級） EDNRB基因啟動子甲基化率之間無明顯差別（X2=0.152.402， P=0.696）。結論 EDNRB基因的甲基化是腫瘤發生的早期事件，EDNRB基因甲基化在腦膠質瘤中較為普遍，與腫瘤進展基本無關。EDNRB基因位于13q22，長約24kb，含7個外顯子和6個內含子，編碼的非選擇性內皮素受體B是一種G蛋白偶聯的跨膜受體蛋白，在人體內分布廣泛，在心血管系統、胃腸道、肺、腎、腎上腺、子宮、前列腺、腦等的血管內皮細胞均有表達。

關鍵詞：EDNRB基因；甲基化；腦膠質瘤

EDNRB基因位于13q22，長約24kb，含7個外顯子和6個內含子，編碼的非選擇性內皮素受體B是一種G蛋白偶聯的跨膜受體蛋白，在人體內分布廣泛，在心血管系統、胃腸道、肺、腎、腎上腺、子宮、前列腺、腦等的血管內皮細胞均有表達。EDNRB基因所在的染色體位點13q22是腫瘤發生過程中一個經常出現基因缺失的區域，目前推測該區域可能有某些腫瘤抑制基因存在，他們對腫瘤的發生發展有著重要的作用。臺灣一項研究發現在白血病患者中EDNRB啟動子甲基化一個普遍現象[1]。法國一項研究顯示EDNRB啟動子甲基化可能在早期診斷前列腺癌中作為一種腫瘤標志物[2]。目前尚未見到在神經膠質瘤中研究EDNRB甲基化狀態的報道。

1臨床資料

取安徽醫科大學第一附屬醫院近2年膠質瘤患者切除腫瘤標本20例。記錄患者的臨床資料包括年齡、性別、腫瘤部位、WHO分類，所有患者均為首次手術，術前均未行放療和化療，采取標本時選取無組織或出血部位。其中男性10例，女性10例。平均年齡45.2歲，腫瘤均為顯微鏡下全切。WHO腫瘤分級：Ⅰ-Ⅱ級8例，Ⅲ-Ⅳ級12例，2例正常腦組織取自腦挫裂傷患者失活腦組織。巢式PCR（nested PCR），是指利用兩套PCR引物（巢式引物）對進行兩輪PCR擴增反應。在第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在在內引物的存在下進行第二輪擴增。外引物F5'-GATTGAATTTTATTTTGGGGTTT-3'，R-TATATCAAACTCTACATTTTACCCC；內引物F5'-AATTATTGATTGAATTTT

ATTTTGGG-3'，R5'-CTG GCC GAA AGA AAG AAA TGGT-3'。首輪PCR的反應體系為25μl。10×PCR buffer2.5μl，dNTP0.5μl，模板4μl，引物（F、R）各1.5μl，MgCl22.5μl，Taq酶0.2μl，加雙蒸水至25μl；PCR反應流程如下：95℃10分鐘預變性，PCR循環99℃ 6min，65℃120min，72℃33min。首輪PCR為30個循環，2μl首輪產物以1：4加雙蒸水稀釋，作為樣本加入次輪反應，重復上述過程。

由于巢式PCR反應有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。

2產物結果測序

根據BSP方法產物測序后結果，若原基因序列CpG島中的C即胞嘧啶發生了甲基化反應，則測序后應保持不變；若原基因序列中的胞嘧啶未發生甲基化反應，則經亞硫酸氫鹽修飾、PCR擴增和測序后應轉變為胸腺嘧啶（T）。根據測序結果可確定目的片段內每個CpG島中胞嘧啶（C）的甲基化狀態，目前是檢測目的基因啟動子區CpG島甲基化水平的金標準。全部測序工作由上海生物芯片公司完成。

用SPSS12.0統計軟件包對實驗數據進行X2檢驗，推斷兩個或兩個以上總體率之間有無差別和兩變量間有無相關關系。采用精確概率法進行統計分析，P<0.05時，表示差異有顯著性。

3結果

所抽提的20例標本中，經檢測有16例DNA質量合格，隨后對此16例標本進行甲基化修飾及測序檢測。

2例正常腦組織中未檢測出EDNRB基因甲基化。16例標本中，檢測出6例標本的EDNRB基因發生了啟動子的甲基化（37.5%，6/16），遠高于正常組織的甲基化率（0%）；但因正常組織數量太少，故二者的差異未行統計學分析。低級別（I-II級）膠質瘤中EDNRB基因啟動子甲基化率為42.86%（3/7），而高級別組（Ⅲ-IV級） EDNRB基因啟動子甲基化率為33.33%（3/9），通過分析表明兩者之間無明顯差別（X2=0.152，P=0.696）。患者年齡、性別、腫瘤病理類型、腫瘤大小和腫瘤部位等因素與EDNRB基因甲基化無明顯相關。

我們對EDNRB基因啟動子甲基化情況與臨床病理資料的關系進行了分析，低級別（I-II級）膠質瘤中EDNRB基因啟動子甲基化率為42.86%（3/7），而高級別組（Ⅲ-IV級） EDNRB基因啟動子甲基化率為33.33%（3/9），通過分析表明兩者之間無明顯差別（X2=0.152.402，P=0.696），本研究沒有發現EDNRB基因甲基化與患者的年齡、性別、腫瘤病理類型、腫瘤大小等因素相關。

4討論

EDNRB基因編碼的非選擇性內皮素受體B是一種G蛋白偶聯的跨膜受體蛋白，在人體內分布廣泛，在心血管系統、胃腸道、肺、腎、腎上腺、子宮、前列腺、腦等的血管內皮細胞均有表達。EDNRB基因所在的染色體位點13q22是腫瘤發生過程中一個經常出現基因缺失的區域，本實驗我們對EDNRB基因啟動子甲基化情況與臨床病理資料的關系進行了分析。實驗發現，EDNRB基因甲基化在腦膠質瘤中的發生率為37.5%，而正常腦組織中未檢測出甲基化現象；說明EDNRB基因的甲基化在腦膠質瘤中是一種較為普遍存在的現象，可能與腫瘤的發生有關。在級別為I-II級的膠質瘤中，EDNRB基因啟動子甲基化率為42.86%（3/7），而高級別組（Ⅲ-IV級） EDNRB基因啟動子甲基化率為33.33%（3/9），通過分析表明兩者之間無明顯差別（X2=0.152.402，P=0.696）；說明EDNRB基因的甲基化可能與腫瘤的進展無關。我們此研究發現，與其他腫瘤的研究報道基本一致：即抑癌基因的甲基化是腫瘤發生的早期事件，而與腫瘤進展基本無關。

腫瘤發生時常出現不同程度的DNA甲基化模式改變，通過對啟動子區高甲基化CpG島的檢測從而發現因DNA甲基化沉默的抑瘤基因，已成為一種尋找腫瘤相關基因的新方法。某些基因高甲基化具有腫瘤細胞特異性，可作為基因標志應用于腫瘤的診斷及臨床預后估價[3]。Toshihiko[4]等研究了20例星形細胞膠質瘤和20例少突膠質細胞瘤組織標本和相應血漿標本中P16基因啟動子的甲基化情況，結果發現60%（12/20）的星形細胞瘤標本和相應的75%血漿標本中可以檢測到P16基因甲基化，而在少突膠質瘤中只有l例發生甲基化，并且腦干星形膠質瘤中均可在血漿中檢測到P16基因甲基化。Weaver等[5]研究膠質瘤患者的腫瘤組織和血漿中的腫瘤特異性DNA甲基化情況，結果發現90%患者的膠質瘤中含有啟動子的甲基化，60%以上患者血漿中也可以檢測到相關基因的啟動子甲基化。因此，某些基因啟動子的甲基化水平能夠作為診斷膠質瘤的生物學指標。但哪些基因具有較高的特異性，哪些可以通過非侵入性方法進行檢測以及更加簡單快速檢測基因甲基化的實驗方法還需要進一步進行研究。

參考文獻：

[1]Yu L，Liu C，Vandeusen J，et a1.Global assessment of promoter methylation in a mouse model of cancer identifies ID4 as a putative tumor suppressor gene in human leukemia[J].Nat Genet，2005，37（3）：265-274.

[2]Tsou JA，Hagen JA，Carpenter CL，et a1.DNA methylation analysis：a powerful new tool for lung cancer diagnosis[J].Oncogene，2002，21（35）：5450-5461.

[3]Sidransky D.Emerging molecular markers of cancer[J].Nat Rev Cancer，2002，2（3）：210-219.

[4]Wakabayashi T，Natsume A，Hatano H，et al.p16 promoter methylation in the serum as a basis for the molecular diagnosis of gliomas[J].Neurosurgery，2009，64（3）：455-461.

[5]Weaver KD，Grossman SA，Heman JG.Methylated tumor specific DNA as a plasma biomarker in patients with glioma[J].Cancer Investigation，2006，24（1）：35-40.

編輯/孫杰