酸性磷酸酶染色特性及陽性細胞鑒別診斷

摘要：宮頸癌在現代女性所患惡性腫瘤中位居第二，如果宮頸癌能及早發現，它屬于極易治愈的癌癥之一。宮頸癌篩查目前被認為是控制宮頸癌發病的最有效手段，可以降低宮頸癌的發病率和死亡率。目前的宮頸癌篩查是采用薄層液基制片技術聯合巴氏染色，受多因素影響，這種方法有一定的局限性。酸性磷酸酶檢測是一種新近應用于子宮頸異常細胞篩查的化學染色及細胞學檢測方法，其檢測原理是宮頸異常細胞中酸性磷酸酶活力升高，利用化學染色方法在有酸性磷酸酶活性的細胞內形成紅色沉淀。本文分析了酸性磷酸酶染色陽性細胞的特征以及與TCT-巴氏染色樣本進行對比觀察，提出酸性磷酸酶染色的細胞學診斷標準及報告方式。

關鍵詞：酸性磷酸酶染色；陽性；鑒別診斷

宮頸癌在現代女性所患惡性腫瘤中位居第二，僅次于乳腺癌。據WHO統計，全球每年約有270 000位女性死于宮頸癌，其中85%發生在中低收入國家。全球每年新增的宮頸癌患者超過50萬人，其中約50%在亞洲。如果宮頸癌能及早發現，它屬于極易治愈的癌癥之一。宮頸細胞從高危型人乳頭狀瘤病毒（high risk human papilloma virus，HR—HPV）持續感染到發展成為癌細胞，是一個逐漸演變的過程，需要l0年或更長時間，如果發現、治療及時，患宮頸癌的女性可以完全康復。有資料顯示，宮頸癌5年生存率分別為Ⅰa期98%～100%；Ⅰb期85%～90%；Ⅱ期65%；Ⅲ期35%；Ⅳ期15%。因此，疾病的早期發現至關重要。世界衛生組織、發達國家的政府以及越來越多的發展中國家的政府都在極力推進和鼓勵21歲～64歲的女性，特別是性行為活躍期的女性，不管年齡大小，每年要進行一次宮頸癌的篩查。目前的宮頸癌篩查是采用薄層液基制片技術聯合使用巴氏（Papanicolaou，Pap）染色來觀察細胞形態學的改變。這是目前發達國家使用的最有效的、性價比最好的宮頸癌篩查方法。遺憾的是，這項技術有很多局限性，如受多因素（取材方法、涂片制作、染色技巧、閱片水平等）的影響，導致假陰性的出現，假陰性率約5%～10%[1]，甚至更高。且過程復雜，難以迎合進行大規模宮頸癌篩查的要求。

酸性磷酸酶檢測是一種新近應用于子宮頸異常細胞篩查的化學染色及細胞學檢測方法。普遍認為宮頸癌與高危型HPV持續感染直接相關，HPV可誘導溶酶體的生成和增強溶酶體酶的活性。宮頸異常細胞中溶酶體酶活性升高主要有兩方面原因：①在宿主細胞中表達的HPV的E7蛋白能顯著誘導依賴溶酶體（lysosome）的自噬（autophagy）系統的水平升高[2-3]；②在宿主細胞中表達的HPV的E6蛋白促進p53降解[2，4-5]，這樣還可以解除p53對細胞自噬-溶酶體系統的抑制，從而增強該系統的活性[6-7]。在溶酶體包含的眾多水解酶中，酸性磷酸酶是有代表性的一種，它的活力可以利用化學染色方法表征，以萘酚鹽作為酸性磷酸酶的底物，利用偶氮化合物與硝酸鹽作用形成的重氮鹽作為偶聯物在有酸性磷酸酶活性的細胞內會形成紅色沉淀。由此，酸性磷酸酶可以作為感染了HPV的宮頸細胞的標志物。

近年來，關于利用“酸性磷酸酶在異型細胞中高表達”原理檢查宮頸異型細胞的報道逐漸增加。1960～1980年間，僅有的兩篇文章報道了宮頸癌細胞內酸性磷酸酶的表達[8-9]，并沒有引起足夠重視。直到1997年后，酸性磷酸酶才被視作一種潛在的宮頸癌檢測生物標志物[10-11]。隨后，有一些研究證實了酸性磷酸酶作為標志物用于宮頸異常細胞檢測的先進性：采用RT—PCR、Western blot和免疫組化法分別檢測正常宮頸、CIN I-III級患者組織中酸性磷酸酶的表達情況，結果證實酸性磷酸酶水平在宮頸癌發生過程中的各級別病變組織中呈明顯增高趨勢[12]。酸性磷酸酶檢測結合巴氏染色可以顯著提高樣本陽性/異常檢出率并且降低假陰性率[13-14]。對TCT結果陽性的病例進行酸性磷酸酶染色復查，結果顯示，與巴氏染色相比，酸性磷酸酶染色較易尋找陽性細胞，閱片時間短，檢測診斷結果的可重復性高。對不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）診斷率減少，低度鱗狀上皮內病變（LSIL）陽性率明顯升高，高度鱗狀上皮內病變（HSIL）及鱗狀細胞癌（SCC）陽性率持平[15]。采用酸性磷酸酶和巴氏染色對婦科門診患者的宮頸脫落細胞進行染色，敏感性100%，特異性高于93%，酸性磷酸酶篩查宮頸異常細胞的檢出率明顯高于巴氏染色[16]。因為此種染色法具有種種優勢，酸性磷酸酶染色有希望成為下一代細胞學檢測所依賴的染色方法。

1 資料與方法

選取2012年1月～2014年3月宮頸細胞TCT檢查診斷正常病例20例和有不典型鱗狀上皮的病例100例，其中不典型鱗狀上皮的病例包括不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）、不排除高度鱗狀上皮內病變（ASC-H）、低度鱗狀上皮內病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內病變（HSIL）及鱗狀細胞癌（SCC）和腺癌，年齡25～67歲。

樣本染色酸性磷酸酶染色應用“宮頸異常細胞快速篩查試劑盒（FSC-811）及保存液”由合肥安旸公司提供。FSC-811保存液保存標本，采用膜式制片（利普制片機，吉林萬方醫療）同時制作兩張薄片。一張巴氏染色，中性樹膠封固；另一張用FSC-811試劑盒進行酸性磷酸酶染色，水性封片劑（合肥安旸）封固。所有樣本評估均為滿意。

2 結果

2.1鏡檢 酸性磷酸酶染色陽性細胞的細胞質中出現紅色顆粒狀沉淀，所有正常鱗狀上皮均為染色陰性。酸性磷酸酶染色陽性細胞包含5種：①正常宮頸腺上皮細胞（柱狀上皮細胞，圖1a，b），細胞質中充滿鮮艷的紅色顆粒；②吞噬細胞，細胞質中充滿鮮艷的紅色顆粒（圖1 c），以上兩種細胞具有很高的自噬-溶酶體活力，所以正常情況下酸性磷酸酶的表達水平非常高，可以作為此種染色的陽性對照細胞；③化生細胞，從柱狀上皮過渡到鱗狀上皮的過程中，酸性磷酸酶表達水平逐漸降低，紅色顆粒逐漸減少直至消失（圖1 d）；④基底層細胞，正常的宮頸上皮細胞中酸性磷酸酶表達隨基底層-中層-表層的成熟過程而逐漸降低[13]，宮頸萎縮樣本中存在的基底層細胞會出現紅色顆粒（圖1e）；⑤不典型鱗狀上皮，各級別的異型細胞均表達酸性磷酸酶，FSC-811染色均為陽性，但單個細胞中的紅色顆粒數量不隨級別的升高而增加，這可能與保存條件和染色操作有關。

因為宮頸腺上皮細胞和吞噬細胞較易辨識，閱片時只需要區分化生細胞、基底層細胞和異常的上皮細胞即可。鏡下僅需要觀察細胞質染紅的細胞，如果不屬于前四種酸性磷酸酶染色陽性細胞，即為異常細胞。

酸性磷酸酶染色與巴氏染色異型細胞鑒別鏡下逐個尋找細胞質出現紅色顆粒狀染色的細胞或細胞團。異常的上皮細胞經過FSC-811染色胞質中出現紅色顆粒，核質比增大，核膜增厚清晰，核異型，深染，核質堆積，多核，部分見核仁，核分裂，胞體增大，細胞離散或細胞堆積，堆積時形成的多核，其邊界呈明顯立體結構的不規則、奇異突起。對胞質紅染而細胞無異型的非陽性對照細胞作出陰性診斷。

2.2酸性磷酸酶診斷標準

2.2.1⑴未見上皮內病變、惡性細胞 ①柱狀和化生細胞紅染，未見上皮內病變、惡性細胞；②鱗狀上皮細胞，未見上皮內病變、惡性細胞。⑵病原微生物。⑶其他非腫瘤所見。⑷子宮內膜細胞≥40歲。

2.2.2上皮細胞異常

2.2.2.1鱗狀上皮細胞異常 ⑴ASC-US：①鱗狀分化，核漿比增高，核大于正常細胞核的2.5倍輕度核深染染色質成塊不規則，模糊不清；②如見到與HPV感染有關的胞漿改變核周空暈；③強嗜橘黃細胞角化不全。⑵ASC-H：①核漿比高的小細胞非典型不成熟化生；②密集成片型濃稠胞漿，其核較正常細胞核大1.5～2.5倍。⑶LSIL：①表層型胞漿的細胞核面積大于中層細胞核的3倍，核深染，染色質均勻分布但常呈出顆粒狀，核膜輕度不規則，但可見光滑；②挖空細胞；③核周胞漿空腔化的細胞，必須同時具有核的異型性。⑷HSIL：病變細胞小而較不成熟細胞大小不一、核深染、核漿比明顯增高核膜很不規則有明顯的內凹或核溝。⑸SCC：①角化型鱗狀細胞癌，細胞大小形狀差異大，核膜不規則，染色質呈出顆粒狀，可見腫瘤素質；②非角化型鱗狀細胞癌，細胞一般比許多高級別病變的細胞小，但具有高級別病變的的大多數特點，染色質粗，塊狀、腫瘤素質常見，核仁大而顯著；③腺上皮細胞異常：非典型腺細胞成片，排列擁擠核，核增大正常核的3～5倍，核大小形狀輕度不一，核輕度深染，胞漿豐富但核漿比增高。

非典型腺-傾向瘤變細胞呈片狀核擁擠重疊，核增大染色質稍增多，核漿比升高，細胞界限不清。

原位腺癌細胞呈片狀，簇狀，核菊蕊團形式，核擁擠重疊，細胞團有呈現柵欄狀排列的細胞核，核及帶狀胞漿從細胞團周邊伸出羽毛狀結構特點。明顯的柱狀形態出現核增大大小不一，核染色過深有均勻分布的粗顆粒狀染色質核漿比增高，背景干凈，核仁明顯。

腺癌與原位腺癌相同，但有侵襲特點，可見巨大核仁，胞漿通常有空泡，可見腫瘤素質。

3 討論

子宮頸脫落細胞酸性磷酸酶檢測作為一種新的檢測方法越來越受到研究人員及病理醫生的關注，此方法在形態學觀察的基礎上加入了生物標志物，提高了細胞學檢測的敏感性和準確性，酸性磷酸酶作用底物產生的紅色物質位于胞漿，結合常規核染色，不僅增加了觀察的可視性，同時使細胞信息最大化，大大縮短檢測時間和減少閱片工作量。

鑒于這種新方法目前沒有國際通用的診治方案，我們提出：子宮頸脫落細胞酸性磷酸酶檢查結果如為低度鱗狀上皮內病變（L-SIL）、高度鱗狀上皮內病變（H-SIL）或傾向于高度病變的不典型鱗狀上皮細胞（ASC-H）時，均應進行陰道鏡下活檢，確定診斷以后再予以相應處理；若細胞學檢查結果為未明確意義的不典型鱗狀上皮細胞（ASC-US）時，不一定要立刻進行陰道鏡檢查，可以3～6個月后重復酸性磷酸酶檢測，若仍為ASC-US，作陰道鏡下活檢。

與巴氏染色相比，酸性磷酸酶染色用于篩查在診斷的時間控制上有一定的優勢，鏡下觀察易識別，色澤與背景具有對比性，反差明顯，易于尋找，層次感強、炎性細胞等因素影響減少，使得診斷更加快捷，這更有利于年青醫師的閱片，也便于應對大批量的篩查工作。酸性磷酸酶檢測的最大優點之一是敏感性高，對于染色陽性的細胞再進一步觀察形態學特征，而不用考慮酸性磷酸酶染色陰性的細胞。在條件較差的基層單位或社區醫院缺乏有經驗細胞學專家的情況下更容易開展篩查工作。

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編輯/王敏