Wnt信號激活劑氯化鋰抑制脂肪細胞分化的研究

【摘要】目的證實Wnt信號激活劑（氯化鋰）可以抑制骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs）向脂肪細胞分化的作用。方法體外培養(yǎng)Balb/c小鼠骨髓基質(zhì)細胞并誘導其向脂肪細胞分化，再用Wnt信號激活劑氯化鋰干預，用油紅O染色觀察脂肪細胞的形成，RT-PCR檢測骨髓基質(zhì)細胞中脂肪細胞PPAR-γ和成骨細胞Runx-2相關(guān)基因的表達。結(jié)論Wnt信號激活劑氯化鋰可以抑制骨髓基質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化。

【關(guān)鍵詞】Wnt信號激活劑；氯化鋰；基質(zhì)干細胞

062文章編號：1004-7484（2014）-06-3056-02

有研究證實Wnt信號可以抑制基質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化，促進其向成骨細胞分化。經(jīng)典Wnt信號通路是Wnt蛋白可以結(jié)合Frizzled受體家族。這些受體的活化使通路中的關(guān)鍵蛋白β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在胞漿中穩(wěn)定并累積，然后進入胞核與TCF/Lef轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而誘導Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。通常，在沒有Wnt信號的情況下，β-catenin不斷地被降解復合物（APC/Axin/GSK-3β）中的GSK-3β在其氨基末端磷酸化，從而被蛋白酶降解。這樣，可以通過抑制GSK-3β使β-catenin在胞漿中積聚從而間接達到Wnt信號活化效應。所以本試驗選擇了GSK-3β的抑制劑氯化鋰（LiCl）來進行研究。又因為再障是一種器官特異性的自身免疫性疾病，環(huán)孢素A作為非細胞特異性的免疫抑制劑，是臨床治療再障的基本藥物。該實驗為氯化鋰聯(lián)合環(huán)孢素A治療再障提供理論基礎，以達到更好的臨床治療效果。

1資料與方法

1.1一般資料動物：雌性Balb/c小鼠（H-2d）8-12周齡，18-22克，由武漢大學實驗動物中心提供。

1.2藥品及試劑氯化鋰、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）均購自美國Sigma公司，胰酶粉劑、油紅O購自美國Amerisco公司，標準胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑、TRIzol試劑購自TaKaRa公司。L-DMEM培養(yǎng)基為美國HyClone-Pierce公司產(chǎn)品。

1.3試劑配制油紅O染液的配制：油紅O干粉0.4g加入10mL異丙醇充分溶解，干液室溫保存。干液和三蒸水以3：2比例混合，過濾、取濾液作為新鮮染液。脂肪細胞分化培養(yǎng)基1：10ml胎牛血清、1mg胰島素、0.1μmol地塞米松、0.05mmolIBMX、90mlL-DMEM。脂肪細胞分化培養(yǎng)基2：10ml胎牛血清、1mg胰島素、90mlL-DMEM。紅細胞裂解液（Tris-NH4Cl）：NH4Cl3.735g加上450ml雙蒸水，Tris堿1.0297g加上50ml雙蒸水，兩者混勻，過濾除菌，待用。

1.4方法

1.4.1正常小鼠骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs）的培養(yǎng)正常小鼠拉頸處死，無菌取下股骨和脛骨，機械分離血管結(jié)締組織，PBS沖洗，用針頭在生長端打孔，注射器將骨髓細胞吹入無血清DMEM培養(yǎng)基中并反復吸沖成單細胞懸液，離心1500r/min×10min。細胞沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸后以20×107/瓶密度接種于100cm2培養(yǎng)瓶中。72h后首次半量換液，以后每3-4天換液一次。11d左右BMSCs約80%匯合，室溫條件下用0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA按1：1混合消化分離細胞并傳代。

1.4.2定向誘導BMSCs向脂肪細胞分化第二繼代細胞以每毫升5×104個接種于6個培養(yǎng)皿中，分為對照組，脂肪細胞組和Licl抑制組。細胞達到80%匯合后對照組繼續(xù)加常規(guī)培養(yǎng)液，脂肪細胞組換成脂肪細胞分化培養(yǎng)基1，Licl抑制組換為脂肪細胞分化培養(yǎng)基1并加入LiCl使其終濃度為20mmol/L。兩天后換液，對照組繼續(xù)加常規(guī)培養(yǎng)液，脂肪細胞組換為脂肪細胞分化培養(yǎng)基2，Licl抑制組換為脂肪細胞分化培養(yǎng)基2再加LiCl使其終濃度為20mmol/L。兩天后，均換為常規(guī)培養(yǎng)液。于培養(yǎng)的第14天將各組細胞做油紅O染色，并取各組細胞約107個，各加入1mlTRIzol用于做RT-PCR。

1.4.3脂肪細胞的檢測每日通過倒置顯微鏡觀察誘導分化的細胞，待分化后的脂肪細胞中脂肪顆粒較多較大時，即大約誘導分化的第14天左右，用油紅O染色，檢測脂肪細胞的數(shù)量，具體方法為：各組細胞用PBS沖洗3次，10%中性甲醛固定10min，油紅O染液浸染10min，60%異丙醇洗去多余染液，PBS沖洗3次，蘇木精復染3-5min，1%鹽酸稍分化，PBS漂洗10min，顯微鏡下觀察。

1.4.4RT-PCR檢測PPAR-γ和Runx-2的半定量表達將各組細胞中的培養(yǎng)液倒掉，各加入1mlTRIzol，吹打混勻后，各移入1.5ml的Eppendorf管中，按照說明書步驟提取RNA，然后在PCR儀上逆轉(zhuǎn)錄，再進行PCR擴增，所用引物序列為PPAR-γ上游5’-3’aagagctgacccaatggttg，下游5’-3’ggatccggcagttaagatca，產(chǎn)物長度296；Runx-2上游5’-3’ggacgaggcaagagtttca下游5’-3’ggtggcagtgtcatcatctg，產(chǎn)物長度465bp，擴增條件：95℃變性5分鐘；94℃變性30秒，58℃復性45秒，72℃延伸45秒，30個循環(huán)；72℃保溫10分鐘。擴增后在瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶的深淺。

2結(jié)果

2.1正常小鼠骨髓基質(zhì)干細胞誘導脂肪細胞組BMSCs培養(yǎng)向脂肪細胞分化的第7天細胞中已開始出現(xiàn)脂肪小滴，隨后幾天脂肪滴逐漸增多，并相互融合，在誘導的第14天做油紅O染色，已形成脂肪細胞，如圖1右所示；而加入LiCl（抑制組）的基質(zhì)干細胞卻沒有向脂肪細胞分化，生長如正?；|(zhì)細胞，如圖1左所示。

2.2各組細胞RT-PCR檢測PPAR-γ和Runx-2基因表達的結(jié)果脂肪細胞組的細胞表達PPAR-γ比Licl抑制組強，而Licl抑制組表達Runx-2比脂肪細胞組強。這就證實了LiCl確實能抑制基質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化（見圖2）。

3討論

3.1間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell）為中胚層發(fā)育的早期細胞具有全能干細胞的特點，能進行多向分化，目前主要來源為骨髓。國內(nèi)外已有大量的實驗證實骨髓MSCs能分化為造血基質(zhì)，支持造血，還可向中胚層和外胚層來源的組織分化。目前認為最有效的認定是分離的細胞能被定向誘導分化為多種間充質(zhì)來源的組織細胞，即定向誘導分化為骨、脂肪、軟骨細胞是判定MSCs的標志。所以我們的試驗未通過分離細胞而是直接向貼壁的細胞中加入脂肪細胞分化液，通過細胞培養(yǎng)分化最終證實MSCs可以向脂肪細胞分化。而加入氯化鋰的細胞抑制組未見有脂肪細胞形成，且RT-PCR實驗結(jié)果證實脂肪細胞的相關(guān)基因PPAR-γ在加入氯化鋰后表達明顯減弱，這些結(jié)果充分證實了Wnt信號可以抑制基質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化，促進其向成骨細胞分化。這也為環(huán)孢素A聯(lián)合氯化鋰治療再生障礙性貧血提供了理論基礎。

3.2Wnt信號與骨髓造血和骨髓基質(zhì)干細胞的作用在造血系統(tǒng)中，造血干細胞（HSC）及骨髓基質(zhì)干細胞均表達Wnt蛋白。Wnt信號途徑被認為在維持HSC自我更新方面有一定作用。轉(zhuǎn)導β—catenin可使HSC增殖并維持其表型，阻斷Wnt信號途徑可使HSC的體外增殖及體內(nèi)造血重建能力降低，純化的Wnt蛋白則能抑制HSC分化并增加其造血能力。此外，Wnt信號能抑制骨髓基質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化，促進其向成骨細胞分化。而成骨細胞對骨髓的造血有重要作用。該實驗采用Wnt信號激活劑（氯化鋰）證實了這個結(jié)論。

圖2 第1、2泳道為內(nèi)參β-actin，可見抑制組細胞和脂肪細胞組細胞的RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄很成功；3泳道為加入LiCl的抑制組細胞逆轉(zhuǎn)錄擴增PPAR-γ基因，4泳道為脂肪細胞誘導組細胞逆轉(zhuǎn)錄擴增PPAR-γ基因，可明顯看出抑制組的PPAR-γ基因表達明顯減低；5泳道為加入LiCl的抑制組細胞逆轉(zhuǎn)錄擴增Runx-2基因，6泳道為脂肪細胞誘導組細胞逆轉(zhuǎn)錄擴增Runx-2基因，可看出抑制組的Runx-2基因表達明顯增強。

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