安全酵母Can dida glycerin ogen esis食品級甘油合成關鍵基因的研究

劉小紅 陳文強 諸葛斌 宗 紅

LIU Xiao－hong 1，2 CHEN Wen－qiang 1 ZHU Ge－bin 2 ZONG Hong 2

陸信曜2 方慧英2 宋 健3

LU Xin－yao 2 FANG Hui－ying 2 SONG Jian 3

（1.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122）

（1.School of Biological Science ＆ Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong，Shaanxi 723001，China；2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education and the Research Centre of Industrial Microbiology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122，China；3.School of Chemical and Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122 China）

甘油是一種應用廣泛的食品安全添加劑，在醫藥、食品、個人護理和化工等1 700個行業［1］有著廣泛的應用。在生理活性方面，甘油具有穩定血糖和胰島素等作用；在果酒行業中，它可以分解果酒中的單寧，提升酒品的品質、口感、去苦味；而在肉干、香腸、臘肉、果脯等產品制作中，可以鎖水，保濕，延長保質期。甘油主要被用作甜味劑、乳化劑、保濕劑、煙草吸濕劑、溶劑［2，3］，另外還可用于改善食品外觀的添加劑［4］。

江南大學［5］采用微生物好氧發酵法生產甘油，已達到年產500 t食品級要求甘油的規模。而對食品級甘油的分子基因水平的研究，目前卻比較少。

產甘油假絲酵母是本研究室學者［6］篩選獲得的一株可以在高滲條件下，高產食品級甘油的安全工業酵母菌株，甘油的合成是葡萄糖首先經磷酸化和醛縮酶的作用形成3－磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，磷酸二羥丙酮在3－磷酸－甘油脫氫酶（CgGPD）的作用下，還原為3－磷酸甘油，此為甘油合成的第一步酶促反應。3－磷酸－甘油在3－磷酸－甘油酯酶（ScGPP2）作用下脫磷酸根而形成甘油，此為甘油合成的最后一個酶促反應。這兩步反應中，第一步為甘油合成的關鍵步驟。而目前對其分子機制的研究較少，本研究通過基因工程改造手段，構建甘油表達體系，進一步提高食品級甘油產量及減少副產物，為降低下游食品級甘油的分離純化的難度提供有效的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與質粒

產甘油假絲酵母 （Can dida glycerinogenesis WL2002－5）、釀酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae W303－1A）、大腸桿菌 （Escherichia coli JM109）、p MD18－T vector、p E tac vector：江南大學工業微生物與生物反應工程研究中心保藏。

1.1.2 培養基配制

LB液體培養基：酵母膏5 g／L，蛋白胨10 g／L，NaCl 10 g／L，p H 7.0；

YEPD培養基：葡萄糖20 g／L，蛋白胨20 g／L，酵母膏10 g／L，瓊脂15～20 g／L，自然p H。

1.1.3 儀器與試劑

PCR儀：ALS1296型，美國BIO－RAD公司；

UVP凝膠成像系統：Alpha Innotech型，英國UVP公司；

p H計：Delta 320型，梅特勒－托利多集團；

回旋式恒溫調速搖瓶柜：HYL－B型，上海新星自動化控制設備廠；

離心機：Allegra X－15R型，Beckman公司；

小型離心機：5415R型，Eppendorf公司；

分光光度計：UV1800型，優尼柯儀器有限公司。

高效液相色譜儀：P680型，美國戴安公司。

各種限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4 Ligase：寶生物工程大連有限公司；

B型小量質粒快速提取試劑盒：北京博大泰克生物技術有限責任公司；

San Prep柱式DNA膠回收試劑盒：上海生工生物工程有限公司；

其余試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增 根據GenBank中CgGPD 基因序列（登錄號 EU186536.1）和ScGPP 2基因序列 （登錄號 NC－001137.3）設計引物（表1）。引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。PCR反應條件：CgGPD擴增程序：預變性：94℃4 min；變性：94℃1 min，復性：59℃30 s，延伸：72℃70 s，共30個循環；保溫：72℃10 min。ScGPP 2擴增程序：預變性：94℃4 min；變性：94℃1 min，復性：57℃30 s，延伸：72℃70 s，共30個循環；保溫：72℃10 min。擴增產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 PCR擴增所用引物Table 1 PCR primers used for amplification

1.2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE） 將重組菌株接種于10 m L LB液體培養基中，OD 值在0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5 m M，30℃誘導表達16 h。收集破碎細胞液，SDS－PAGE檢測表達情況。采用5%濃縮膠和12%分離膠的不連續垂直平板電泳進行蛋白分離，考馬斯亮藍 R－250染色［7］。

1.2.3 CgGPD和ScGPP2粗酶液的制備 參照文獻［8］。將過夜誘導表達的菌液于4℃以10 000 r／min離心10 min，菌體用細胞洗滌液（KH2PO410 m M，K2HPO410 m M，EDTA 2 m M，p H 7.5）洗滌兩遍，然后懸于10 m L破細胞緩沖液中 （KH2PO4100 m M，K2HPO4100 m M，DTT 1 m M，MgCl21 m M，EDTA 2 m M，p H 7.5）。采用超聲波法破壁細胞（功率300 W，工作1 s隔3 s，工作3 min），于4℃以10 000 r／min離心10 min，上清即為粗酶液。

1.2.4 酶活測定方法

（1）3－磷酸甘油脫氫酶酶活的測定［8］：GPD活性的檢測在檢測緩沖液（20 m M 咪唑－HCl，p H 7.0；1 m M DTT；1 m M MgCl2；0.67 m M DHAP；0.09 m M NADH 中進行，酶促反應溫度為30℃。無NADH氧化酶本底。在340 nm處測定30 s和90 s的吸光度。一個酶活單位定義為1 min消耗1μM NADH所需的酶量。

（2）3－磷酸甘油酯酶酶活測定：取稀釋好的濃度為1 mg／m L的粗酶液50μL，加入0.2 M DL－磷酸甘油10μL，1 M，p H 7.0咪唑10μL，0.25 M MgCl210μL，總體積為0.1 m L。在30℃的恒溫水浴中，反應1 min后加入2 m L 5%的三氯乙酸終止反應，離心，取上清液測其無機磷含量。在30℃，p H 7.0的條件下，每分鐘催化3－磷酸甘油產生1μM磷酸根所需要的酶量為1個酶單位。

1.2.5 蛋白含量測定 采用Bradford法［9］，以BSA為標準蛋白。

1.2.6 產物檢測方法 Dionex高效液相色譜儀測定，色譜柱為 Amines HPX－87H（Bio－Rad）有機酸離子交換柱，柱溫60℃，流動相為5 m M H2SO4，流速為0.6 m L／min。使用示差折光及紫外檢測器，使用外標定量法定量［10］。

2 結果與分析

2.1 關鍵酶基因CgGPD及ScGPP 2的克隆

以產甘油假絲酵母和釀酒酵母基因組DNA為模板，以P1，P2，P3，P4為引物，擴增獲得大小分別約為1 100 bp和750 bp的Cg GPD和ScGPP 2片段，與Genbank公布的基因序列大?。? 167 bp和753 bp）一致［7］，結果見圖1。

圖1 CgGPD和ScGPP 2的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析Figure 1 Agarose gel electrophoresis of CgGPD and ScGPP 2 genes

2.2 關鍵基因表達質粒的構建

質粒構建過程如圖2所示，基因片段CgGPD純化后用EcoRⅠ，Hin dⅢ雙酶切，與相同酶切的載體p E tac連接，并轉化E.coli感受態細胞；克隆所得基因片段ScGPP 2，用SacⅠ，XhoⅠ 雙 酶 切， 與 酶 切 的p E tac 連 接； 以p E tac－ScGPP 2質粒DNA為模板，擴增兩端有Hin dⅢ 和XhoⅠ位點的tac－ScGPP 2目的片段，與雙酶切的pE tac－CgGPD 連接，完成雙啟動子pE tac－CgGPD－tac－ScGPP2表達質粒構建。用含有kan抗性的平板篩選轉化子，同時，酶切驗證，結果見圖3、4（a）。

2.3 關鍵基因表達及活性分析

重組菌株 E.coli （pE tac－Cg GPD－tac－ScGPP2）過夜誘導，收集菌體，超聲波破碎細胞，進行SDS－PAGE，重組菌釋放出的目的條帶約42 k Da和27 kDa，與文獻［8］報道的大小一致，確定為3－磷酸甘油脫氫酶和為3－磷酸甘油酯酶（見圖4（b））。

圖2 重組質粒p E tac－CgGPD－tac－ScGPP 2的構建Figure 2 Construction of the plasmid of p E tac－CgGPD －tac－ScGPP 2

圖3 p E tac－Cg GPD 和p E tac－ScGPP 2的酶切驗證Figure 3 The enzymatic digestion of the plasmid p E tac－Cg GPD and p E tac－ScGPP2

圖4 p E tac－CgGPD－tac－ScGPP2的酶切驗證及SDS－PAGE檢測Figure 4 The enzymatic digestion and SDS－PAGE analysis of the plasmid p E tac－Cg GPD－tac－ScGPP 2

經酶活檢測（表2），在E.coli（p E tac－CgGPD）和E.coli（p E tac－CgGPD－tac－ScGPP 2）菌株中CgGPD 酶活分別為0.12 U／mg和0.06 U／mg。在E.coli（p E tac－ScGPP 2）和E.coli（p E tac－CgGPD－tac－ScGPP 2）菌株中ScGPP 2酶活分別是0.03 U／mg和0.01 U／mg。3－磷酸甘油脫氫酶是甘油合成過程中的關鍵酶基因，其酶活的高低直接影響著甘油的合成，本研究中Cg GPD具有相對較高的酶活，對甘油合成有著重要作用。SDS－PAGE及酶活性分析結果表明，甘油合成基因在大腸桿菌中進行了功能性表達。

2.4 關鍵基因表達菌株的發酵

E.coli（p E tac－CgGPD－tac－ScGPP2）菌株經發酵培養，在1%，2%，3%，4%葡萄糖濃度下，經48 h后，其胞外甘油分別累積到1.35，1.87，2.52，2.25 g／L，而對照野生菌株中卻沒有檢測到甘油（圖5），表明CgGPD在甘油合成過程中起關鍵作用，過表達CgGPD有助于甘油合成。與劉艷青等［8］構建的串聯表達載體合成1.56 g／L甘油相比，本研究所采用的雙啟動子串聯表達，更有利于甘油合成。

表2 酶活及甘油濃度測定Table 2 The specific activity of CgGPD and ScGPP2

圖5 不同葡萄糖濃度下甘油含量Figure 5 Concentration of glycerol under difference conditions

3 結論

本中心已對產甘油假絲酵母甘油合成的高滲調控機制（HOG途徑）做了很多的研究［11，12］，這些研究對高產食品級甘油具有至關重要的理論指導作用。本課題為了進一步提高食品級產量及減少副產物，減輕下游分離純化的壓力，研究其甘油合成機制中甘油合成關鍵基因，克隆獲得關鍵酶基因3－磷酸－甘油脫氫酶基因（CgGPD），并在大腸桿菌中通過tac啟動子串聯表達來自釀酒酵母的3－磷酸 －甘油酯酶基因（ScGPP 2）。在搖瓶發酵過程中可合成2.52 g／L的甘油。相比之前的研究［7］，食品級甘油合成量提高了1倍，結果說明通過tac啟動子串聯表達CgGPD基因，可以獲得更高的甘油含量。此研究表明3－磷酸 －甘油脫氫酶（CgGPD）在甘油合成過程中起關鍵作用，過表達CgGPD有助于甘油合成。

1 王震，饒志明，沈微.甘油合成關鍵酶基因CgGPD 1在大腸桿菌和產甘油假絲酵母中的表達［D］.江蘇：江南大學，2008.

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7 聶玲燕，方慧英，諸葛斌，等.克雷伯氏菌產1，3－丙二醇菌株選育及甘油脫水酶基因轉錄分析［J］.應用于環境生物學報，2013，19（1）：25～29.

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12 Xiaona Gao，Bin Zhuge，Huiying Fang，et al.The construction of a new integrative vector with a new selective marker of copper resistance for glycerol producer Can dida glycerinogenes ［J］.Curr Microbiol，2012（64）：357～364.