酶解菌質(zhì)水溶性膳食纖維表面顯微結(jié)構(gòu)及成分研究

余有貴 李忠海

YU You－gui 1 LI Zhong－h(huán)ai 2

（1.邵陽學(xué)院，湖南 邵陽 422000；2.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004）

（1.Shaoyang University，Shaoyang，Hunan 422000，China；2.Central South University of Forestry Technology，Changsha，Hunan 410004，China）

膳食纖維是一種不能被人體消化的碳水化合物，具有預(yù)防肥胖癥、增強(qiáng)免疫、防止糖尿病、預(yù)防結(jié)腸癌、抑制有害菌等作用［1－5］，被稱為第七大營養(yǎng)素。根據(jù)它在水中的溶解特性分為水溶性膳食纖維（SDF）與不溶性膳食纖維（IDF）兩種基本類型。SDF主要發(fā)揮代謝功能，影響碳水化合物和脂類的代謝，在預(yù)防糖尿病、心血管疾病，降低膽固醇和清除外源有害物質(zhì)等方面具有比IDF更強(qiáng)的生理功能［6－9］。本研究在原有蕨渣膳食纖維資源開發(fā)、提取工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上［10－13］，進(jìn)一步對酶解菌質(zhì)水溶性膳食纖維的表面顯微結(jié)構(gòu)及組成成分進(jìn)行研究，為其理化特性和生理功能的作用機(jī)理研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝－蕨渣菌質(zhì)粉：本實驗室參照文獻(xiàn)［11］制備；

α－淀粉酶：4 000 U／g，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

木瓜蛋白酶：40萬U／g，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

纖維素酶：3 000 U／g，湖南尤特爾生化有限公司；

Dextran T－10、Dextran T－40、Dextran T－70、Dextran T－500：北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；

鼠李糠、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖：上海博奧生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

水浴恒溫振蕩器：SHA－B型，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；

氣相色譜儀：GC－2010型，日本島津公司；

高效液相色譜儀：waters600型，美國Waters公司；

掃描電子顯微鏡：Quanta－200型，荷蘭Fei公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌質(zhì)水溶性膳食纖維 稱取一定量的靈芝－蕨渣菌質(zhì)粉［11］，按料水比1∶4（m∶V）加入蒸餾水，用3 mol／L的NaOH溶液調(diào)節(jié)p H至6.0，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的木瓜蛋白酶，在45℃水浴攪拌60 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的α－淀粉酶，在68℃水浴攪拌45 min，去除菌質(zhì)粉中的蛋白質(zhì)和淀粉。取出水解醪冷卻至50℃，用磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)p H至5.0，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%的纖維素酶，在50℃下水浴攪拌240 min。然后，煮沸滅酶，10 min。將酶的水解醪冷卻至室溫，離心（4 000 r／min，20 min）得到上清液，用4倍體積的95%乙醇沉淀、離心（4 000 r／min，5 min），取沉淀物在0.05 MPa下真空干燥2 h［13］，備用。

1.3.2 菌質(zhì)SDF顯微結(jié)構(gòu)觀察 樣品用戊二醛固定，采用濺射鍍膜法對固定后的菌質(zhì)SDF樣品進(jìn)行表面鍍金，將表面鍍金的樣品置于掃描電鏡下觀察［14］。

1.3.3 菌質(zhì)SDF單糖組成測定 用氣相色譜法進(jìn)行單糖分析，采用氫火焰離子檢測器（FID），以標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的出峰時間來對菌質(zhì)SDF樣品進(jìn)行定性。

（1）膳食纖維水解及單糖衍生化：采用完全酸水解法，稱取0.2～0.5 g菌質(zhì)水溶性膳食纖維于圓底燒瓶中，先用72%（m／m）的硫酸溶脹2 h，加水稀釋至2 mol／L，置恒溫水浴中100℃水解8 h，水解液用碳酸鋇中和、過濾，濾液經(jīng)冷凍干燥得到游離單糖。再稱取干燥的單糖樣品10 mg，加入0.5 m L吡啶、10 mg鹽酸羥胺和1.5 mg肌醇內(nèi)標(biāo)，于烘箱中90℃保持30 min，取出冷卻后再加入0.5 m L乙酸酐，放回烘箱中90℃保持30 min，待處理后的樣品冷卻后進(jìn)行氣相色譜（GC）分析。

（2）色譜條件：色譜柱為30 m×0.32 mm×0.25μm的OV 1701石英毛細(xì)管柱；FID檢測器；氣化室溫度260℃；檢測器溫度250℃；程序升溫：起始溫度190℃保持3 min，以5℃／min的升溫速率升至240℃，保持20 min；載氣（N2）壓力58.839 9 k Pa；燃?xì)猓℉2）壓力63.743 2 kPa；助燃?xì)猓諝猓毫?9.033 3 k Pa；分流比30∶1。

1.3.4 菌質(zhì)SDF分子量分析

（1）樣品制備：50 mg樣品用蒸餾水完全溶解并定容至50 m L，搖勻后用0.45μm尼龍微孔膜過濾，取濾液進(jìn)樣，采用高效液相色譜（HPLC）法測定。

（2） 色 譜 條 件：色 譜 柱 為 Sugarpakl（6.5 mm×300 mm）；流動相為純水；柱溫85℃；流速0.5 m L／min；進(jìn)樣體積為10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌質(zhì)SDF的顯微結(jié)構(gòu)

菌質(zhì)SDF的表面顯微結(jié)構(gòu)見圖1。菌質(zhì)SDF表面有許多皺折，形成多孔的蜂窩狀空腔和明顯的裂縫，這表明酶的作用使得菌質(zhì)水溶性膳食纖維的微觀結(jié)構(gòu)和分子大小發(fā)生了改變。同時，蜂窩狀的結(jié)構(gòu)增大了顆粒的表面積，從而有助于其提高水合性質(zhì)，如果它與膽酸鹽或其它物質(zhì)和溶劑相接觸時，便能形成更多的毛細(xì)管，且有更多的親水基團(tuán)和親油基團(tuán)暴露到表面，將具有更大的吸附容量［15－17］，這為其物理特性和生理功能提供了形態(tài)學(xué)方面的依據(jù)。

圖1 菌質(zhì)SDF的顯微結(jié)構(gòu)Figure 1 Microstructure of fungal substance soluble dietary fiber

2.2 菌質(zhì)SDF的單糖組成

標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的GC分析圖譜見圖2，各單糖組成見表1。菌質(zhì)SDF樣品經(jīng)氣相色譜儀分析的結(jié)果見圖3，按照保留時間與單糖標(biāo)樣聯(lián)合定性，內(nèi)標(biāo)法定量，確定菌質(zhì)SDF水解后單糖組分的相對含量見表2。菌質(zhì)水溶性膳食纖維主要單糖組分是葡萄糖，占總含量的92.452 8%，然后依次含有少量的甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖。木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖是組成半纖維素的主要單糖，葡萄糖是組成葡聚糖的主要單糖［17］。因此，初步推斷菌質(zhì)SDF的主要成分來源于葡聚糖、半纖維素。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酸衍生物的GC分析圖譜Figure 2 The map of Acrylic acid derivatives of Standard monosaccharides by GC

表1 標(biāo)準(zhǔn)單糖的含量Table 1 The content of tandard monosaccharides

2.3 菌質(zhì)SDF的分子量分布

以不同分子量標(biāo)準(zhǔn)右旋糖酐的分離保留時間（RT）與相應(yīng)的分子量對數(shù)值（lg Mol Wt）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，R ＝0.999 6，試驗結(jié)果表明，重均分子量的對數(shù)值與保留時間呈良好線性關(guān)系。

圖3 菌質(zhì)SDF樣品水解后的GC分析圖譜Figure 3 The map of hydrolysised samples of fungal substance soluble dietary fiber by GC

表2 菌質(zhì)SDF樣品酶解后單糖組分相對含量Table 2 The relative content of monosaccharide composition of hydrolysised samples of fungal substance soluble dietary fiber

圖4 HPLC法測定相對分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 4 Standard curve of relative molecular weight distribution measured by HPLC

采用高效液相色譜分析菌質(zhì)SDF分子量分布圖譜見圖5，菌質(zhì)SDF的Mn（數(shù)均分子量）、Mw（重均分子量）、Mp（峰值分子量）的結(jié)果見表3。SDF根據(jù)分子量分為低聚SDF（120～620 Da）、中聚 SDF（1 800～16 000 Da）、多聚SDF（16 000～160 000 Da）［6］，而菌質(zhì)SDF分子量分布主要有2個峰，重均分子量為1 772 Da的峰含量為68.75%、289 Da的峰含量為31.25%。表明纖維素酶的水解作用，破壞了菌質(zhì)纖維多糖的糖苷鍵以及多糖鏈內(nèi)、鏈外間的氫鍵作用力，使得纖維多糖發(fā)生降解，分子鏈被切斷，分子量相對降低，導(dǎo)致聚合度下降，從而使菌質(zhì)SDF成為低聚糖SDF。

重均分子質(zhì)量（Mw）與數(shù)均分子質(zhì)量（Mn）的比值為多糖摩爾質(zhì)量多分散系數(shù)（d），其大小可以作為判斷樣品分子質(zhì)量分布是否均一的指標(biāo)［18］，d越大，說明分子量越分散；d＝1，說明分子量呈單分散縮聚產(chǎn)物；d＝2，為自由基產(chǎn)物；d＝3～5，說明存在支化。菌質(zhì)SDF的1＜d＜2，說明通過酶水解制備的菌質(zhì)SDF分子量呈單分散縮聚產(chǎn)物。

圖5 菌質(zhì)SDF的分子量分布圖Figure 5 Mw distribution of fungal substance soluble dietary fiber

表3 菌質(zhì)SDF分子量測定結(jié)果Table 3 The results of molecular weight of fungal substance soluble dietary fiber by HPLC

3 結(jié)論

（1）菌質(zhì)SDF表面有許多皺折，形成多孔的蜂窩狀空腔和明顯的裂縫，比表面積大，為發(fā)揮物理特性和生理功能提供了形態(tài)學(xué)方面的依據(jù)。

（2）經(jīng)復(fù)合酶對靈芝－蕨發(fā)酵的固體菌質(zhì)進(jìn)行水解、純化，獲得的菌質(zhì)SDF的單糖組分為葡萄糖92.452 8%、甘露糖3.787 1%、阿拉伯糖1.545 6%、半乳糖1.313 2%和木糖0.901 3%。

（3）菌質(zhì)SDF的相對分子量為1 772 Da占68.75%、289 Da占31.25%，說明菌質(zhì)SDF為低聚糖SDF和呈單分散縮聚產(chǎn)物。

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