超聲結合蘋果酸處理對雙孢蘑菇多酚氧化酶活性及失活動力學的影響

周 磊 劉 偉 熊志強 鄒立強 方志超

ZHOU Lei LIU Wei XIONG Zhi－qiang ZOU Li－qiangFANG Zhi－chao

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330047，China）

多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）普遍存在于植物、真菌及昆蟲的質體中，是自然界中分布極廣的一種氧化還原酶，PPO在植物細胞組織中的位置會因原料的品種、種類及成熟度的不同而存在差異［1，2］。由PPO誘導的酶促反應使果蔬在貯藏、運輸及加工過程中發生褐變反應，褐變反應在很大程度上影響果蔬的營養及感官等各種品質。因此，抑制褐變反應在果蔬貯藏、運輸過程中十分的重要。

對PPO進行改性一直是PPO研究的熱點，其中主要的應用手段有：化學方法（如添加亞硫酸鹽［3］、有機酸［4，5］等）；物理方法（如熱處理［6，7］、脈沖電場［8］、靜高壓［9］）等；多種處理手段結合使用的方法（如超聲結合熱處理［10］、高壓與溫度相結合［11］、抗壞血酸結合熱處理［12］等）。在本課題組先前的研究中利用了動態高壓微射流［13，14］對PPO進行處理。目前，關于有機酸單獨處理對PPO活性影響的報道較多，顧林等［4］研究發現抗壞血酸及檸檬酸能有效抑制山藥PPO的活性，趙東海等［5］報道了半胱氨酸及抗壞血酸對蘑菇PPO具有較強的抑制效果。本課題組研究報道了檸檬酸對蘑菇PPO的抑制效果，PPO經60 mmol／L的檸檬酸處理后基本失活［15］。超聲作為一種非熱手段在食品行業有著廣泛運用，有許多研究報道了超聲結合其它手段處理PPO，如Cheng等［10］運用超聲結合熱處理對PPO失活動力學進行研究，Ba?lar等［16］研究了超聲結合紫外對蘋果汁PPO活性的影響。蘋果酸與超聲結合對PPO活性及失活動力學的研究則還沒有報道，蘋果酸作為一種有機酸存在于許多果蔬中，在食品行業中常作為酸味調節劑來使用，因此，超聲結合蘋果酸的運用在工業上具有一定的可行性。

本試驗以雙孢蘑菇PPO為原料，首先用不同濃度的蘋果酸對蘑菇PPO進行處理，測定處理后PPO的相對活性。選取中等濃度的蘋果酸結合超聲對PPO進行處理，測定中等濃度的蘋果酸結合超聲處理對PPO活性的影響，計算失活速率常數 （k）、D 值及半衰期（t1／2）的變化。本研究為更好的利用蘋果酸及超聲抑制PPO的活性提供理論基礎，對控制果蔬的酶促褐變具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇PPO：活性700 U／mg，美國 Worthington Biochemical公司；

蘋果酸：分析純，阿拉丁試劑上海有限公司；

鄰苯二酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：分析純，天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞破碎儀：JY88－II型，寧波新芝生物科技有限公司；

紫外光譜儀：PC－1600型，上海美譜達公司。

1.3 方法

1.3.1 PPO活性的測定 參照Liu等［14］的方法，反應底物共2.9 m L，其中含2.7 m L 50 mmol／L、p H 6.8的磷酸緩沖溶液與0.2 m L 2 mmol／L的鄰苯二酚溶液，反應前將底物溶液在水浴鍋中于37℃下恒溫20 min。取酶液0.1 m L與底物混合，立即于420 nm波長下測定反應5 min前后其吸光度的變化。

酶活力的定義：每分鐘內每毫升酶液于420 nm波長處吸光度變化0.001定義為1個酶活力單位。相對活性的定義見式（1）。

1.3.2 蘋果酸對PPO溶液的處理 稱取不同質量的蘋果酸，分別用10 m L 50 mmol／L、p H 6.8的磷酸緩沖液溶解成濃度為20，30，40，50，60，80，100，120 mmol／L 的蘋果酸溶液。稱取20.00 mg PPO，將其溶解于100 m L 50 mmol／L磷酸緩沖液（p H 6.8）配制成0.2 mg／m L PPO 溶液。分別取10 m L不同濃度的蘋果酸溶液與10 m L PPO溶液混合，最后PPO的濃度為0.1 mg／m L，蘋果酸的最終濃度分別為10，15，20，25，30，40，50，60 mmol／L。處理20 min后測定不同濃度的蘋果酸對PPO活性的影響。

1.3.3 超聲對PPO溶液的處理 稱取2 mg PPO溶解于20 m L 50 mmol／L磷酸緩沖液（p H 6.8）配制成0.1 mg／m L PPO溶液，立即將超聲波細胞破碎儀的探針置于裝有PPO溶液的燒杯中，于冰浴條件下進行超聲處理，探針伸入液面3 cm。超聲頻率為25 k Hz，功率為250 W，超聲時間分別為10，20，30，40，50，60 min。

1.3.4 超聲結合蘋果酸對PPO溶液的處理 選取中等濃度的蘋果酸（15，20，25 mmol／L）結合超聲對PPO進行處理：按方法1.3.2得到中等濃度蘋果酸（15，20，25 mmol／L）處理后的20 m L PPO溶液，立即將超聲波細胞破碎儀的探針置于裝有PPO溶液的燒杯中，于冰浴條件下進行超聲處理，探針伸入液面3 cm。超聲頻率為25 k Hz，功率為250 W，超聲時間分別為10，20，30，40，50，60 min。

1.3.5 失活動力學的分析 酶的失活動力學可用一級方程進行表達：

式中：

At—— 樣品經過t min處理后的相對酶活，U／min；

t—— 處理的時間，min；

k—— 失活速率常數，min－1。

可將上述一級反應方程式轉變成式（3）：

式中：

A0—— 原酶活，U／min。

可根據上述式（3），以t為橫坐標，相對酶活的對數ln（At／A0）為縱坐標作出失活曲線圖，并通過曲線斜率計算出各濃度蘋果酸結合超聲處理PPO的失活速率常數（k）。

可通過式（4）、（5）分別計算出半衰期t1／2和10倍減少時間D值。

式中：

t1／2—— 酶失活50% 所需的時間，min；

D——酶失活90%所需時間，min。

1.3.6 數據分析及處理 每個試驗重復3次，取平均值。用SAS軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度蘋果酸處理對PPO相對活性的影響

由圖1可知，PPO相對活性隨著蘋果酸濃度的增加逐漸下降，蘋果酸濃度低于25 mmol／L時PPO活性變化較小；蘋果酸濃度為30，40，50 mmol／L時PPO受到比較明顯的抑制。當蘋果酸濃度達到60 mmol／L時PPO活性受到強烈抑制。由此可見高濃度的蘋果酸對蘑菇PPO的抑制效果比較明顯。

圖1 不同濃度的蘋果酸對PPO相對酶活性的影響Figure 1 Effect of malic acid on relative activity of PPO

于新等［17］研究發現100 mg／L的蘋果酸、檸檬酸、酒石酸可有效抑制草菇PPO的活性，李曉莉等［18］報道了0.1 mol／L的L－抗壞血酸、檸檬酸及蘋果酸對山藥PPO具有抑制作用，但蘋果酸的抑制效果比L－抗壞血酸及檸檬酸弱一些。本課題組先前研究［15］發現蘑菇PPO經60 mmol／L的檸檬酸處理后其相對活性僅剩4.3%，這比本研究中60 mmol／L的蘋果酸對蘑菇PPO的抑制效果更加明顯。由此可見，有機酸對PPO相對活性的影響與PPO的來源、有機酸的種類及濃度有關。

2.2 超聲結合蘋果酸對PPO活性的影響

由圖2可知，PPO經30 min超聲處理后其相對活性保持在90%以上，經60 min超聲處理后其相對活性仍有81.8%，由此可見單獨超聲對PPO活性的影響較小，抑制效果不明顯；PPO經15 mmol／L蘋果酸處理30 min后其相對活性為86.6%，之后隨時間的變化比較緩慢，經60 min處理后，抑制效果也不明顯。超聲結合15 mmol／L蘋果酸的處理對PPO活性影響較大，PPO相對活性隨處理時間的增長不斷下降。處理60 min后其相對活性為40.6%；超聲結合20 mmol／L蘋果酸對PPO的抑制效果明顯；PPO 經25 mmol／L蘋果酸處理60 min后，顯示出一定的抑制作用，但與超聲結合處理60 min后PPO完全失活。超聲結合25 mmol／L蘋果酸對PPO具有強烈的抑制作用。

單獨使用超聲或中等濃度（15，20，25 mmol／L）蘋果酸對蘑菇PPO的抑制效果均不明顯，但超聲與蘋果酸結合處理則能使PPO活性得到明顯的抑制。Cheng等［10］報道超聲結合熱處理對PPO的抑制效果明顯強于單獨超聲或單獨熱處理對PPO的抑制作用。Jang等［19］報道利用超聲結合抗壞血酸處理蘋果鮮切片，其PPO在鮮切片的儲藏過程中受到更加顯著的抑制。Ba?lar等［16］則報道了超聲結合紫外處理對PPO的抑制效果更加明顯。超聲對PPO具有抑制作用可能是因為聲激波產生強大的剪切力破壞了蛋白質多肽鏈上的氫鍵及范德華力［20］。

圖2 超聲結合蘋果酸處理對PPO活性的影響Figure 2 Effect of combing ultrasound with malic acid on activity of polyphenol oxidase

2.3 超聲結合蘋果酸對PPO失活動力學的影響

由圖3可知，經超聲以及超聲結合中等濃度蘋果酸處理后的PPO的失活動力學符合一級動力學方程，相關系數R2如表1所示，范圍為0.934～0.971。由圖3得到各曲線的斜率從而得出失活速率常數（k），進而計算得到超聲結合各濃度的蘋果酸處理PPO的D值及半衰期t1／2。由表1可知，單獨超聲處理的PPO的k 值為0.33×10－2min－1，超聲與蘋果酸結合處理后其失活速率常數隨蘋果酸濃度的增加而變大，其中25mmol／L的蘋果酸所對應的k值達到4.36×10－2min－1，這與單獨超聲相比具有明顯的升高。超聲與蘋果酸結合處理后PPO的D值明顯變小，蘋果酸濃度越高D值越小，當蘋果酸的濃度為0，25 mmol／L時D 值分為690.9，52.6 min。半衰期t1／2隨蘋果酸濃度的升高也逐漸變小，當蘋 果 酸 的 濃 度 為0，25 mmol／L 時t1／2分 別 為208，15.9 min。

圖3 超聲結合蘋果酸處理PPO的失活曲線Figure 3 Inactivation curve of PPO treated with the combination of malic acid and ultrasound

表1 超聲結合蘋果酸處理PPO的k值、D值、t 1／2Table 1 The value of k、D、t 1／2 of PPO treated with the combination of malic acid and ultrasound

有研究［10］報道超聲結合熱處理PPO與單獨超聲或單獨熱處理相比，其失活速率常數k明顯增大，且其k值隨熱處理溫度的升高而變大，D值及半衰期t1／2則隨熱處理溫度的升高而變小，這與本研究結果相似。由此可見，單獨超聲對PPO的抑制效果較弱，但與其它處理手段相結合可起到明顯的抑制效果。

3 結論

隨著蘋果酸濃度的增加，PPO的相對活性逐漸降低，當蘋果酸濃度達到60 mmol／L時，PPO基本完全失活，其酶活性僅為9.1%。單獨的超聲處理和中等濃度的蘋果酸處理對PPO抑制效果并不是很明顯。但是超聲結合中等濃度的蘋果酸處理能夠顯著的降低PPO酶活性。如分別經單獨超聲處理、20 mmol／L蘋果酸處理和超聲結合20 mmol／L蘋果酸處理60 min后PPO 活性分別為81.8%，79.7%，12.6%。超聲結合中等濃度蘋果酸處理PPO失活過程均符合一級動力學方程，且失活速率常數（k）隨著酸濃度的增加而增大，當蘋果酸濃度分別為0，25 mmol／L時，其失活速率常數 （k）為0.33×10－2，4.36×10－2min－1。同時 D 值、半衰期（t1／2）隨著蘋果酸濃度增大而變小并且明顯低于單獨超聲處理的PPO，當蘋果酸濃度分別為0，25 mmol／L時，其D 和t1／2分別為690.9，208.0 min和52.6，15.9 min。

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