羅非魚內臟蛋白酶解超濾產物的抗氧化活性研究

郭善廣 榮 婧 郭利平 楊 寧 蔣愛民

GUO Shan－guang 1 RONG Jing 1 GUO Li－ping 2 YANG Ning 3 JIANG Ai－min 1

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.廣東輕工職業技術學院，廣東 廣州 510300；3.廣東省對外科技交流中心，廣東 廣州 510033）

（1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642，China；2.Guangdong Light Industry College of Technology，Guangzhou，Guangdong 510300，China；3.Guangdong Science ＆ Technology Exchange Centre，Guangzhou，Guangdong 510033，China）

羅非魚屬鱸形目 （Perciformes）麗鯛科（Cichlidae）羅非魚屬（Tilapia），是原產于熱帶、亞熱帶的暖水性魚類。羅非魚肉質厚、骨刺少，富含多種不飽和脂肪酸、易于加工保鮮，是公認的優質蛋白來源。目前中國羅非魚產量占世界總產量的55%，是世界最大的羅非魚養殖生產國，羅非魚的年產量達到1×106t以上［1］。在羅非魚加工過程中，每年產生魚頭、魚皮、魚排以及內臟等加工副產物大約2×105t［1］。目前部分副產物用來生產飼料，有的甚至被廢棄導致環境污染。副產物利用的廣度和深度仍然有待進一步拓展。

本研究利用酶法降解羅非魚內臟蛋白得到可溶性多肽，并采用超濾將水解產物進行分級分離。擬應用體外抗氧化試驗對水解產物和超濾分級產物進行評價，分析比較產物的還原能力、清除DPPH自由基能力、清除超氧陰離子能力及抑制卵黃磷脂氧化能力。旨在為羅非魚副產物的深度加工提供試驗依據和理論基礎，有利于提高副產物的利用效率、拓展其應用領域。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羅非魚內臟：收集于廣州市天河區長湴農貿市場，洗凈、絞碎后放于－20℃冰箱內冷凍，試驗時取出解凍即可使用；

胰蛋白酶：2 500 U／mg，廣州齊云生物技術有限公司。

1.2 主要儀器與設備

冷凍高速離心機：5804R型，德國艾本德儀器公司；

電子天平：PL203型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

數顯電熱鼓風干燥箱：DHG－9073BS－III型，上海新苗醫療器械有限公司；

全溫振蕩器：QYC－2102C型，上海福馬實驗設備有限公司；

紫外可見分光光度計：UV－1800型，島津儀器有限公司；

精密p H計：PHS－3C型，上海虹益儀器儀表有限公司；

凱式定氮儀：Kjeltec TM 8100型，福斯分析有限公司；

索式脂肪測定儀：2043型，福斯分析有限公司；

磁力攪拌器：78－1型，常州澳華儀器有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH－4型，常州澳華儀器有限公司；

循環水真空泵：SHZ－DIII型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

切向流超濾系統：Labscale小型，密理博中國有限公司。

1.3 羅非魚內臟蛋白酶水解產物的制備

冷凍魚內臟在室溫解凍，按比例加入適量的蒸餾水，用1 mol／L的NaOH或HCl調節至所需的p H，加酶恒溫水浴水解。根據預試驗確定的羅非魚內臟酶解產物制備工藝如下：起始p H 8.0，溫度50℃，料液比1∶3（m∶V），胰蛋白酶加酶量1 500 U／g·原料，水解時間4 h。水解結束后用沸水浴滅酶10 min，于3 000×g離心20 min，取中間澄清液層即蛋白酶解液檢測其抗氧化特性。蛋白酶解液的氮收率可以達到84.21%，水解度為49.13%。酶解液的上層為脂肪，可回收利用。

1.4 超濾分離羅非魚內臟酶解液

酶解液在超濾分離之前，采用0.45μm的微孔濾膜過濾，真空抽濾去除酶解液中的固形物及雜質，防止在超濾分離時堵塞膜組件，影響超濾分離。試驗采用截留分子量為10，5 k Da 2個膜組件進行分離，可以得到3種酶解產物，分子量分布分別為（I）＞10 k Da，（Ⅱ）5～10 kDa，（III）＜5 k Da。

1.5 水解度及氮收率的測定

（1）水解液中氨基態氮采用甲醛電位滴定法測定，水解度按式（1）計算：

式中：

DH—— 水解度，%；

AN——酶解液中游離氨基態氮的總量，g；

AN0——酶解前原料液游離氨基態氮的總量，g；

TN——羅非魚內臟原料中總氮量，g。

（2）采用凱氏定氮法測定水解液的含氮量，并按式（2）計算氮收率：

式中：

NR—— 氮收率，%；

C1—— 水解液中總氮含量，g；

C2—— 原料總氮量，g。

1.6 產物抗氧化能力評價

酶解產物采用下述方法進行測定，用VC作為陽性對照樣品。

1.6.1 還原力測定 采用 Oyaizu法［2］。添加樣品后，反應體系在700 nm處吸光度的變化可以表明Fe2＋和Fe3＋之間的轉變，從而表征樣品的還原能力。吸光值越大，表示樣品還原能力越強［2］。

1.6.2 清除DPPH自由基能力測定 參照文獻［3］，取蒸餾水配制一系列濃度梯度的樣品溶液。以無水乙醇配制濃度為0.01 mmol／L的DPPH 溶液。取2.0 m L DPPH 溶液及2.0 m L樣品混合、振搖，暗處靜置30 min后，于517 nm處測吸光度A值；以不同濃度梯度的VC溶液作為陽性對照。

1.6.3 清除超氧陰離子能力測定 參照文獻［4］。

1.6.4 抑制卵黃磷脂氧化能力測定 參照文獻［5］。

2 結果與分析

2.1 羅非魚內臟蛋白酶解產物的抗氧化活性分析

2.1.1 酶解產物還原力分析 還原力檢測方法可以評價試樣是否具有良好的預防性抗氧化功能。樣品在700 nm處地吸光值越大，樣品的總還原力就越強［2］。選用具有較強抗氧化性的VC作為對照品，以此比較說明樣品還原能力的大小。圖1顯示了酶解產物及VC的還原力評價結果。

圖1 羅非魚內臟酶解產物（以含氮量計）及VC的還原能力Figure 1 Reducing power of tilapia viscera hydrolysates（total nitrogen content）and of VC

由圖1可知，在擬合區間內（試驗樣品濃度范圍），各試樣的還原力與其濃度有明顯的正相關性；回歸分析也表明還原力與樣品濃度之間呈現線性關系。酶解產物和VC的還原力擬合方程分別為y ＝0.225 3x＋0.298 2（R2＝0.996 4），y ＝12.88x＋0.164 4（R2＝0.989 3）。 如果設定還原力的吸光值均為0.5，所需酶解產物氮濃度為0.896 mg／m L，而所需VC濃度僅為0.026 mg／m L，此時VC的還原力約為酶解產物的42.89倍。酶解產物的還原力雖然不如VC，但對還原Fe3＋還是具有一定的效果。酶解液的還原能力可能是由于所含肽中存在一些具有供氫能力的氨基酸殘基（如Tyr等）引起的。羅非魚內臟蛋白肽鏈的斷裂增加了有效氫離子，能夠作為良好的電子供體打斷自由基的鏈式反應，從而達到抗氧化效果。

2.1.2 酶解產物清除 DPPH 自由基分析 DPPH（1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl）分子含有較為穩定的自由基，試驗中DPPH乙醇溶液為紫蘿蘭色，在517 nm下有高吸收值，結合試樣后，吸光值降低。吸光值越低表示試樣清除DPPH自由基的能力越強［6］。該方法目前廣泛應用于抗氧化物質的評價。

由圖2可知，酶解物和VC對DPPH自由基的清除作用均呈現出明顯的量效關系，隨濃度的增加，清除DPPH自由基的作用增強。酶解產物和VC對DPPH自由基的清除率擬合方程分別為y ＝150.85x＋3.44（R2＝0.999 1），y ＝8 174.9x－15.163（R2＝0.995 9）。酶解產物對DPPH的清除作用的IC50值較VC大，為0.309 mg／m L，而VC對DPPH的清除作用的IC50值僅為0.008 mg／m L；酶解產物清除DPPH自由基能力比VC要低，但其濃度達到0.6 mg／m L時，清除效率亦可達到94.67%。

圖2 羅非魚內臟酶解產物（以含氮量計）及VC清除DPPH自由基能力Figure 2 DPPH radical scavenging activity of tilapia viscera hydrolysates（total nitrogen content）and of VC

2.1.3 酶解產物清除超氧陰離子能力分析 超氧陰離子是帶有一個未成對電子的自由基。超氧陰離子可存在于人體內，它自身不發生化學變化而危害人體，但與羥自由基結合的產物會導致細胞DNA損壞，破壞人體機能。目前多采用鄰苯三酚法［7］、黃嘌呤－黃嘌呤氧化酶法［8］、腎上腺素法［9］、NBT法［10］測定樣品的超氧陰離子自由基清除率，而鄰苯三酚自氧化法操作更為簡便。

圖3和4顯示，添加酶解物和VC后，鄰苯三酚自氧化速率明顯低于空白對照組。而且隨著酶解物和VC濃度增高，自氧化速率降低。圖5更直接地表明酶解物和VC對超氧陰離子的清除作用均呈現出量效關系，隨濃度的增加，超氧陰離子的清除作用增強。酶解產物和VC清除超氧陰離子能力擬合方程分別為y ＝5.865x＋19.36（R2＝0.997 9），y ＝76.786x＋14.643（R2＝0.994 1）。酶解產物對超氧陰離子清除作用的IC50值為5.224 mg／m L，而VC對超氧陰離子清除作用的IC50值為0.460 mg／m L。當酶解產物的氮濃度為10 mg／m L時，對超氧陰離子的清除率可達77.07%。說明羅非魚內臟蛋白酶酶解物具有較好的超氧陰離子自由基清除活性。本試驗中發現羅非魚內臟酶解產物對超氧陰離子的清除能力不及對DPPH的清除能力。劉成梅等［11］也有類似發現，羅非魚魚皮多肽對DPPH自由基的抑制作用強于對超氧陰離子自由基的抑制作用。

圖3 酶解產物（以含氮量計）抑制鄰苯三酚自氧化速率Figure 3 Hydrolysates（total nitrogen content）inhibit pyrogallol autoxidation rate

圖4 VC抑制鄰苯三酚自氧化速率曲線Figure 4 VC inhibit pyrogallol autoxidation rate

圖5 酶解產物 （以含氮量計）及VC清除超氧陰離子能力Figure 5 Scavenging hydroxyl radical activities of hydrolysates（total nitrogen content）and of VC

2.1.4 酶解產物抑制卵黃磷脂氧化能力分析 在卵黃磷脂體系中，金屬離子誘導其中的磷脂、脂蛋白和脂肪酸等成分發生脂質過氧化反應，生成丙二醛（MDA）。MDA在酸性加熱條件下，可與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成粉紅色的硫代巴比妥酸反應物（TBARS），在532 nm處有特征吸收［12］。當體系中有抗氧化物質存在時，MDA生成量減少，終產物TBARS的產量也會減少，因此可通過吸光值的變化來評價脂質過氧化反應的程度。

由圖6可知，酶解物和VC對脂質過氧化的抑制作用均表現出明顯的量效關系，隨濃度的增加，脂質過氧化的抑制作用增強，說明羅非魚內臟水解產物有抑制脂質過氧化的能力。酶解產物和VC抑制脂質過氧化氧化能力擬合方程分別為y ＝ －8.623 3x2＋44.519x＋17.455（R2＝0.998 2），y ＝56.727x2－16.842x＋41.119（R2＝0.990 6）。 在擬合區間內，酶解產物對脂質過氧化的抑制能力與VC較為接近，其IC50值為0.882 mg／m L，對照VC對脂質過氧化抑制作用的IC50值為0.571 mg／m L，當酶解物產物的氮濃度1.5倍于VC溶液濃度時，二者對脂質過氧化抑制作用相當。說明羅非魚內臟蛋白水解物具有良好的脂質過氧化抑制活性。脂質過氧化抑制能力高于斑鰶魚蛋白控制酶解物［13］的。該研究［13］顯示，酶解物蛋白含量為10 mg／m L時，脂質過氧化抑制率為59.61%；本試驗結果顯示，當酶解產物的氮濃度為1.57 mg／m L時，脂質過氧化抑制率可達65.70%。

圖6 酶解產物（以氮含量計）及VC抑制脂質過氧化反應能力Figure 6 Hydrolysates（total nitrogen content）and VC inhibit lipid peroxidation

2.2 超濾分級分離羅非魚內臟蛋白酶解液

羅非魚內臟蛋白酶解液經超濾分離后得到不同分子量范圍的3個組分，按氮含量計算3個組分得率見圖7。

圖7 酶解產物超濾后組分分布圖（以氮含量計）Figure 7 Hydrolysate fraction after ultrafiltration（total nitrogen content）

由圖7可知，羅非魚內臟蛋白經胰酶水解后，酶解產物的分子量范圍比較寬泛，其中組分II最多，氮含量占到41.38%。加上組分III，分子量小于10 k Da的多肽占到79.97%。大分子的組分I含量最少，表明酶解比較充分。

2.2.1 超濾分離各組分清除DPPH能力分析 酶解產物的抗氧化分析表明，產物對DPPH產生的自由基比較敏感，IC50值最小，僅為0.309 mg／m L，水解產物DPPH自由基的清除容量高。因此以DPPH自由基清除率為指標進行超濾后酶解產物抗氧化能力的評價。圖8直觀地表明，超濾后，酶解產物各組分對DPPH自由基的清除率能力大小排序為組分III＞未超濾酶解液＞組分Ⅱ＞組分I。因此可以基本確認組分III即分子量＜5 k Da的水解產物抗氧化能力最強。而未超濾酶解液中含有組分III，因此其自由基清除能力較高，而且高于其他兩種分離組分。

圖8 超濾分離各組分清除DPPH能力Figure 8 DPPH radical scavenging capacities of ultrafiltration fractions

采用SPSS軟件分析酶解物各組分對DPPH自由基的清除作用并擬合得出回歸方程見表1。由表1可知，隨著截留分子量的降低，各組分的IC50值呈降低趨勢，對DPPH自由基的清除能力逐漸增強。與未超濾的酶解產物相比，組分Ⅰ和組分Ⅱ的IC50值較大，其對DPPH自由基清除能力有所降低；組分III的IC50最小，僅為0.090 mg／m L，對DPPH自由基的清除能力比超濾前的酶解產物有顯著提高（P＜0.01），說明超濾可以富集酶解產物中的抗氧化活性肽?？寡趸姆肿恿烤容^小，氨基酸殘基的數目一般在20個以內［14］。

2.2.2 超濾組分III的抗氧化能力 超濾可以將不同分子量大小的肽分級并富集，其抗氧化能力的表現更具有均一性，可以選擇性能更好的組分進行應用。組分III的抗氧化能力進一步分析（見表2）表明，超濾后總的抗氧化能力有明顯的提高，但是對不同抗氧化體系提高的程度有所不同。相對于原液，組分III的清除超氧陰離子能力提高幅度明顯高于其他抗氧化體系，其IC50值由原液的5.224 mg／m L大幅降至0.714 mg／m L，與VC的IC50值處于同一個數量級。組分III的抗氧化活性高于未超濾的酶解產物，這可能是由于小分子肽暴露的活性基團更多，與自由基和金屬離子接觸位點增多，一方面通過相互作用力抑制新的自由基的產生；另一方面作為氫供體可與已經產生的自由基發生反應，形成穩定的產物，阻止了自由基的鏈式反應［15］。最近有研究［14］表明，超濾后分子量小于5 kDa的蛋黃酶解產物有較強的抗氧化能力，其抗氧化能力與其分子量、磷含量及氨基酸組成有關，但具體的原因還有待于探討。超濾可以有效地將酶解產物分級，分級后產物的抗氧化能力更為均一，因此可以有效地集聚抗氧化活性較強的水解產物。

表1 超濾分離各組分清除DPPH能力的回歸分析Table 1 Regression analysis of DPPH radical scavenging capacities of ultrafiltration fractions

表2 組分III與酶解原液的抗氧化能力（IC 50值）的比較Table 2 Comparative analysis of antioxidant capacities of fraction III and enzymatic hydrolysate／（mg·m L－1）

3 結論

羅非魚內臟經過酶水解后得到可溶性的多肽，水解產物在還原力、清除DPPH自由基能力、清除超氧陰離子能力及抑制脂質過氧化能力測試中顯示出良好的抗氧化能力。水解產物經超濾分級后，3種組分與水解原液的清除DPPH自由基能力大小排序為組分III（＜5 kDa）＞原液＞組分II（5～10 k Da）＞組分I（＞10 k Da）。還原力、清除超氧陰離子能力及抑制脂質過氧化氧化能力測試表明分子量＜5 kDa的組分III具有更強的抗氧化能力。本研究表明，羅非魚內臟酶解產物經超濾分離可以有效地分級濃縮抗氧化肽片段，也進一步確證小分子肽的抗氧化活性更強，但其組成結構及相關機制還有待進一步研究。

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