不同純化方法對花生多糖抗氧化活性的影響

劉光憲 馮健雄 王 輝

LIU Guang－xian 1，2 FENG Jian－xiong 1，2 WANG Hui 3

祝水蘭1，2 周巾英1，2 付曉記1，2

ZHU Shui－lan 1，2 ZHOU Jin－ying 1，2 FU Xiao－ji 1，2

（1.江西省農業科學院，江西 南昌 330200；2.國家花生加工技術研發分中心，江西 南昌 330200；3.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

（1.Jiangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanchang，Jiangxi 330200，China；2.National R＆D Subcenter for Peanut Processing，Nanchang，Jiangxi 330200，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330047，China）

冷榨制油技術因其加工條件溫和、蛋白變性程度低等優點越來越受到消費者及加工企業的關注［1］。冷榨花生餅是冷榨制油的主要副產物，近年來，冷榨花生餅的應用主要有制備小分子肽、提取高純度蛋白粉、提取花生粗多糖及其功能特性的研究等［2－4］，但是多數研究是對花生中提取的粗多糖進行功能特性的研究，在花生多糖純化及高純度花生多糖的性質等領域的研究未見相關研究報道［5－7］。

人工合成的抗氧化劑如BHA和BHT等存在毒性和致癌性，其食用安全性備受關注，在食品加工中的應用受到了限制。近年來，植物抗氧化劑如多糖、酚類、抗氧化肽、植酸、花色苷色素等因具有安全、抗氧化活性強等優點而備受重視［8，9］，制備植物抗氧化劑，開展推廣應用研究成為了熱點。

本研究擬采用不同純化方法分離純化花生多糖，并考察不同純度花生多糖的抗氧化活性，以期為花生多糖的分離純化及應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

冷榨花生餅粕：山東德州宏鑫花生蛋白有限公司；

葡萄糖、3，5－二硝基水楊酸、DEAE－52 Cellulose、Sephadex G－200：分析純，美國Sigma公司；

耐高溫α－淀粉酶：酶活力2萬U／m L，美國Sigma公司；

糖化酶：酶活力10萬U／m L，美國Sigma公司；

透析袋：截留分子量3 500，美國Sigma公司；

疊氮化鈉、1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH）、VC、鄰苯三酚、水楊酸、雙氧水、鹽酸、對氨基苯磺酸、七水合硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸萘乙二胺：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器

紫外可見分光光度計：T6新世紀型，北京普析通用儀器有限責任公司；

臺式離心機：TDL－5－A型，上海安亭科學儀器廠；

冷凍干燥機：LGJ－1型，北京亞泰科隆儀器技術有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH－4型，常州國華電器有限公司；梯度混合器：TH－500A型，上海琪特分析儀器有限公司；

恒流泵：BT1－100E型，上海琪特分析儀器有限公司；

電腦全自動部分收集器：DBS－100－LCD型，上海琪特分析儀器有限公司；

酸度計：Delta 320型，梅特勒－托利多國際股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 多糖含量的測定 以葡萄糖為標準品，采用苯酚－硫酸法測定，經分析，回歸方程為A ＝0.007 3x＋0.006 4（R2＝0.999 1）。 表明葡萄糖質量在16～72μg范圍內，吸光值與葡萄糖含量呈良好的線性關系。

1.2.2 花生粗多糖的提取 參照文獻［5］的方法提取花生多糖，醇沉、離心、冷凍干燥后得花生粗多糖，經測定花生多糖的含量為46.45%。

1.2.3 花生多糖的分離與純化

（1）分離：參照文獻［2］的方法采用雙酶水解解法進行純化，花生多糖提取溶液先后經耐高溫α－淀粉酶、糖化酶處理，滅酶后離心、過濾收集上清液，冷凍干燥得PPS－a組分，經測定其花生多糖含量為78.12%。

（2）純化：花生多糖提取液采用木瓜蛋白酶－TCA法［5］脫蛋白后，經DEAE－52纖維素離子交換柱層析純化，經蒸餾水洗脫再用0.223 mol／L NaCl線性梯度洗脫，可得到兩個主要的多糖組分PPS－1和PPS－2，其花生多糖的含量分別為17.79%和66.93%。

1.2.4 花生多糖的抗氧化活性測定方法 以PPS－a、PPS－2為原料，以VC為對照，研究其抗氧化活性。

（1）羥自由基（·OH）的測定：參照文獻［10］。

（3）DPPH自由基清除活性的測定：參照文獻［12］。

（4）抗脂質過氧化能力的測定：參照文獻［13～16］。

2 結果與分析

2.1 花生多糖清除羥自由基（·OH）的能力

由圖1可知，兩種花生多糖提取物對·OH自由基均具有清除作用，在濃度為1.0～6.0 mg／m L時，抑制率隨濃度的增加而增強，經測定清除羥自由基的半抑制濃度（IC50）分別是3.51，4.47 mg／m L，PPS－a對·OH 的清除活性高于PPS－2，并與VC（IC50＝4.49 mg／m L）處于同一水平。但在濃度大于5 mg／m L時，兩種多糖的活性均高于VC，PPS－a組分清除·OH自由基的能力大于PPS－2組分。

圖1 多糖溶液對·OH自由基的清除效果Figure 1 ·OH radical scavenging activity of the polysaccharides solutions

2.2 花生多糖清除超氧陰離子自由基（O·）的能力

由圖2可知，花生多糖提取物（PPS－a、PPS－2）對O·都具有清除作用，且抑制率隨著濃度的升高而增大，通過測定其消除超氧陰離子自由基的半抑制濃度（IC50）分別是3.02，7.31 mg／m L，表明多糖組分PPS－a清除O·的活性高于PPS－2組分。但與VC相比多糖的抗氧化活性較低。

圖2 多糖溶液對O的清除效果Figure 2 O·radical scavenging activity of the polysaccharides solutions

2.3 花生多糖清除DPPH·自由基的能力

由圖3可知，兩組花生多糖均具有清除DPPH·自由基的能力，清除活力隨花生多糖濃度的增加而增強，花生多糖PPS－a清除DPPH·能力高于多糖PPS－2組分。當PPS－a的濃度為1.0 mg／mL時，其對DPPH·的清除率可達56.19%。經測定，這兩個多糖組分的IC50值分別為0.856，1.697 mg／m L，PPS－a組分清除DPPH·自由基的能力大于PPS－2組分。與VC相比多糖的抗氧化活性較低。

圖3 多糖溶液對DPPH·的清除效果Figure 3 DPPH radical scavenging activity of the polysaccharides solutions

2.4 花生多糖還原力

由圖4可知，花生多糖（PPS－a、PPS－2）均具有還原能力，且隨多糖濃度的增大而增強，在濃度為8 mg／m L時，OD值分別為0.378和0.476，而VC的OD值為2.50，由此可看出花生多糖的還原能力約為VC的16%左右，PPS－a組分還原能力大于PPS－2組分。

圖4 花生多糖的還原力Figure 4 Reducing power of the polysaccharides solutions

2.5 花生多糖抗脂質過氧化能力

由圖5可知，在濃度為0～10 mg／m L時，花生多糖（PPS－a、PPS－2）抗脂質過氧化能力隨濃度的增加而增強，經測定在10 mg／m L濃度時，抑制率分別為73.09%和56.86%，計算得出IC50分別為7.69，7.98 mg／m L，表明花生多糖PPS－a的抗脂質過氧化能力較高，但都不如VC。

3 結論

采用雙酶（耐高溫α－淀粉酶、糖化酶）水解純化得到的花生多糖其抗氧化活性較DEAE－52纖維素柱層析法得到的花生多糖強；采用雙酶水解法純化多糖類物質，通過酶的專一性、高效性能有效實現雜質的分解去除，進而提高多糖的純度；但兩種純化方法得到的花生多糖的結構差異及其對抗氧化活性的影響仍需要進一步研究。

圖5 多糖抗脂質過氧化能力Figure 5 Anti－lipid peroxidation activity of the polysaccharides solutions

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