一則海洋微生物天然藥物化學綜合實驗的教學設計

李春遠，丁唯嘉，王秀芳，羅志剛，谷文祥

（1.華南農業大學 理學院，廣東 廣州 510642；2.廣東藥學院 藥科學院，廣東 廣州 510006）

天然藥物化學是運用現代科學技術和方法研究天然產物中活性成分的學科［1］，是中藥學、藥學、制藥工程、有機化學、應用化學等藥學或化學類相關專業本科或碩士研究生的一門專業課，具有很強的實踐性，其中的天然藥物主要是指陸生中草藥。隨著研究的深入，藥物資源從陸地拓展到海洋，為適應這種新的進展，《天然藥物化學》（第5版，人民衛生出版社）教材新增了第十章“海洋天然產物”［2］。天然藥物化學實驗課程在天然藥物化學教學中占有重要的地位，是理論知識和實際操作的紐帶，通過實驗不僅能夠使學生掌握天然藥物有效成分提取、分離和結構鑒定的基本操作技能，而且能夠更好地培養學生的科學思維以及創新意識與創新能力［3］。然而目前國內各高校開設的天然藥物化學成分提取分離實驗的研究對象主要包括大黃、槐米、漢防己、麻黃、肉蓯蓉等，幾乎全部為陸生植物，少有報道在天然藥物化學實驗教學中開設有關微生物或海洋天然產物的實驗內容，學生缺乏對微生物及海洋天然產物研究意義和研究方法的直觀認識，不利于對天然藥物化學課程相關內容的學習。我們提出在天然藥物化學、天然有機化學等相關專業的實驗課程中，優選實驗內容開設海洋微生物天然產物提取分離綜合性實驗，以充分發揮實驗教學平臺的作用，促進學生對天然藥物化學更加全面深刻的認識。

1 優選實驗對象及實驗目標產物

傳統海洋天然產物的研究對象海藻、海綿等無脊椎動物［4］，數量有限，采集會對生態平衡造成一定破壞，而以海洋微生物為對象則具有成本低、可人工發酵、環境友好等特點［5］。海洋微生物包括海洋真菌、細菌等，其中海洋真菌發酵耗時長，靜置培養通常需要25d左右，搖床培養也需要14d左右，而細菌發酵周期則較短，搖床培養僅需3～7d。因此，從學生實驗的時效性考慮，海洋細菌成為首選。另一方面，作為學生實驗，不宜以未研究過的新奇菌株為對象。

Bacillus sp.是一類在自然界分布廣泛的革蘭氏陽性菌，其代謝產物絕大多數為生物堿，種類相對單一，主要包括環二肽和大環脂肽類化合物［6－9］。其中環二肽等小分子生物堿不僅具有廣泛的抗菌、抗腫瘤等生物活性［10］，而且組成單元相對固定，結構鑒定和分離純化等實驗流程易于重復。因此，在任課教師科研項目研究成果的基礎上，我們選擇一株分離自湛江海岸泥沙的芽孢桿菌Bacillus sp.ms12為對象。該菌主要代謝產物為色氨酸和環（苯丙－脯）二肽，我們以這2種物質為目標產物，優化菌株發酵條件、優選提取分離純化方法，設計了適合于相關專業本科生和研究生開設的綜合性實驗方案。

2 優化發酵條件

為提高學生實驗的效率，先通過單因素法結合正交試驗優化了菌株Bacillus sp.ms12的發酵條件。優化后的實驗發酵條件為：蛋白陳7g，酵母粉3g，牛肉膏3g，葡萄糖2g，海鹽25g，水1 000mL，接種量5%，搖床振蕩培養7d。在上述發酵條件下，每實驗小組僅需發酵0.6L即可分別成功分離到10mg左右的色氨酸和環（苯丙－脯）二肽。無論是發酵量、發酵時間還是目標產物產率等，都十分適合學生綜合性實驗開設的要求。

3 優選提取、分離及純化方法

3.1 采用大孔吸附樹脂進行提取

微生物代謝產物提取實驗通常使用有機溶劑如乙酸乙酯、正丁醇等直接對發酵液萃取的方法［11－12］，該方法消耗溶劑量大［13］、萃取時間長、收率低［14］，在萃取過程中還經常由于相分離不完全而產生乳化現象［15］等。相對于傳統的有機溶劑液液提取方法，大孔吸附樹脂由于具有低消耗、高效率、高選擇性、后續處理簡單并且可再生等優勢，在農藥、生化藥物的分離純化以及中成藥的制備等方面的應用越來越廣泛［16－19］。因此，從學生實驗高效化、綠色化的角度考慮，我們采用了大孔吸附樹脂法替代有機溶劑提取法。

根據文獻報道，4g的XAD－16型大孔樹脂可吸附高達1L海洋微生物Chromocleista sp.發酵液中的環二肽等小分子含氮化合物［20］，表明該樹脂對小分子生物堿具有優秀的吸附能力。我們的預實驗表明XAD－16樹脂應用于菌株Bacillus sp.ms12，對發酵液中代謝物質的靜態吸附量可達到樹脂體積的7～10倍，并且所吸附的生物堿物質較易被無毒的洗脫劑乙醇水溶液解吸出來，用2～3倍樹脂體積的70%乙醇的水溶液即可使其基本解吸完全。該方法既克服了液液萃取過程中溶劑揮發對環境的污染，又節省大量的有機溶劑，并且樹脂再生后可以繼續使用，既節能又環保。

3.2 引入超聲波法進行洗脫分離。

目前對飽和大孔吸附樹脂解吸主要有動態洗脫和靜態洗脫2種方式［21］。其中動態洗脫采用飽和樹脂裝柱，然后用蒸餾水及不同洗脫劑將吸附物洗脫出來。這種洗脫方式由于樹脂置于色譜柱中無法使用超聲等加速解吸，需要消耗相對較多的溶劑和時間以保證洗脫完全。超聲提取技術利用超聲波的空化作用可加速欲提取成分的溶出，另外超聲波的次級效應，如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等，也能加速欲提取成分的擴散釋放并充分與溶劑混合，利于提取［22］。因此，有必要在解吸過程中使用超聲波輔助以提高效率。

我們設計采用了動靜態洗脫相結合的方式：將飽和樹脂置于三角瓶中，先用蒸餾水浸泡，超聲5min，用布氏漏斗抽濾，濾液保留備用；然后將樹脂重新轉移至三角瓶中，依次用50%乙醇水（用來除去非目標產物的干擾雜質）、70%乙醇水（洗脫出目標產物）及乙醇（洗脫出柱中的其他成分）洗脫劑重復上述步驟。與普通動態洗脫相比，本方法只用1／3的溶劑即可洗脫出相同的提取量，同時還節省了大量的時間和能源。本步完成后繼續用蒸餾水對樹脂進行洗滌至無醇味，樹脂即可再次循環使用。對于收集到不同洗脫溶劑的濾液采用旋轉蒸發儀代替普通蒸餾裝置進行減壓蒸餾，可以在較低的溫度下溫和又快速地對樣品進行濃縮，同時又減少了因試劑揮發到空氣中而污染環境，收集到的試劑還可以回收再利用。

3.3 利用制備薄層純化單體化合物

制備薄層層析原理與柱層析相似，都是利用硅膠吸附性能使得不同物質在各種極性溶劑條件下解吸能力差異而進行分離純化［23］。在具體實驗操作上，柱層析需要經過裝柱、壓柱、上樣、不同溶劑洗脫及洗脫液濃縮檢識合并等步驟，由于樣品從柱底流出且柱體積相對較大，導致解吸過程緩慢，需要消耗大量溶劑，耗時較長。制備薄層層析使用自制或購置的薄層板，由于薄層均勻嚴實，不存在氣泡，其分離效果要優于柱層析。同時制備薄層置于展開缸中層析，所需溶劑量大大減少，展開后可根據紫外或顯色劑檢視刮取目標物色帶，直接用少量大極性溶劑在短柱中洗出即可。因此相對而言，制備薄層層析更加簡便快速且綠色化，更適合學生實驗少量樣品的分離純化。

點樣是制備薄層層析操作的關鍵，由于分離的樣品量大，一般不使用圓點點樣而采用條帶點樣。若用常規的玻璃毛細管或滴管帶狀點樣，容易劃傷薄層，且常出現上樣濃度分布不均勻、上樣帶太寬或不齊等情況，影響分離效果。對此，我們采取的解決措施為在滴管頭處塞上一小段脫脂棉，慢慢將樣品刷到制備薄層板上。制備薄層層析方法對菌株Bacillus sp.ms12的70%乙醇水分段提取物進行純化，效果良好，在1.5h內，只用100mL試劑即可獲得15mg色氨酸和8mg環（苯丙－脯）二肽2種目標產物。

4 用核磁共振氫譜法（HNMR）對實驗產品進行表征

核磁共振是天然產物結構鑒定及化學反應機理研究等最常用的工具之一［24－25］，但現有教材提供的天然產物的核磁共振譜圖數量很少，且多數比較陳舊，同時由于不是自己分離得到，學生在學習結構解析時普遍缺乏興趣，積極性不高。在此現狀下，我們把HNMR融入到海洋微生物代謝產物分離純化實驗教學中，引導學生利用所學的理論知識解析自己所分離的化合物的結構。

學生首先對薄層純化所得產品進行薄層檢視，選取薄層層析中斑點單一、純度高的樣品。樣品真空干燥后，裝入核磁管，隨后放入核磁共振儀，依次輸入進樣、鎖場、勻場、采樣等指令得到譜圖。教師引導學生從峰的種類與質子、積分高度與質子數、化學位移數值與官能團（基團）關系等幾處入手，學生通過認真觀察分析得出結果。分析圖1，鑒定出化合物1為環（苯丙－脯）二肽，分析數據與文獻［26］基本一致。分析圖2，推測分子是色氨酸，數據與色氨酸標準品HNMR數據符合。

圖1 實驗分離到的環（苯丙－脯）二肽的HNMR譜

圖2 實驗分離到的色氨酸的HNMR譜

學生完成上述結構解析后，教師引導學生依次思考如下問題：

（1）如何運用HNMR判斷所分離物質中有無雜質？

（2）自己所分離的化合物的純度情況如何？

（3）雜質未被充分除去的原因？

（4）如何進一步增加所分離化合物的純度？

學生運用學到的知識結合教師提示和自己的實驗操作等環節解決問題，給出答案。此步驟由學生在撰寫實驗報告階段完成。學生為用HNMR譜表征自己分離得到的產品結構而感到高興，整個過程激發了學生的成就感與創新欲望，使學生較好地掌握了HNMR譜表征與推知天然產物結構的方法。

5 結束語

與陸源生物的次生代謝產物相比，海洋生物由于生活環境更加復雜、物種更加多樣，使得其天然產物具有很多新型的骨架和獨特的化學結構，在生物活性方面也具有更強烈的作用。近年來，國內外天然產物學家普遍認為從海洋微生物發掘活性物質是利用海洋天然產物結構多樣性，同時解決生物資源難再生、保護生態環境的最佳選擇。海洋微生物已成為尋找藥物先導化合物的一個新的源泉［27］。與此大背景不相符的是當前國內高校極少開設海洋微生物天然產物提取分離實驗，究其原因，主要是因為微生物發酵周期長、代謝產物成分復雜，同時提取分離純化過程需消耗大量溶劑，耗資且耗時。針對上述困難，我們依托于自身科研項目，精選一株代謝產物較為簡單的海洋細菌為實驗對象，限定目標產物，以綠色化學思想為指導設計實驗方案，通過優化菌株發酵條件、優選提取分離純化方法，不僅使實驗學時、菌株發酵量、溶劑消耗、環境污染等降到最低，而且確保高效率地分離純化出目標產物，并指導學生運用HNMR鑒定產物結構。該實驗有助于學生全面深刻地認識海洋微生物天然產物的科學研究流程、增加學生學習興趣、提升學生操作技能和創新能力。實驗所積累的大量單體化合物還可以進一步加以利用，進行各種生物活性測試或開展結構修飾研究，成為大學生研究性或設計性實驗項目的原料，衍生出更多新的創新內容。

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