人腦膠質瘤中Fas、Caspase-8的表達

梁曉陽，劉洛同，明揚，陳禮剛

（瀘州醫學院附屬醫院神經外科，四川 瀘州 646000）

·論著·

人腦膠質瘤中Fas、Caspase-8的表達

梁曉陽，劉洛同，明揚，陳禮剛

（瀘州醫學院附屬醫院神經外科，四川 瀘州 646000）

目的探討不同級別膠質瘤中Fas、Caspase-8的表達情況。方法針對68例經病理證實的人腦膠質瘤組織標本和15例正常對照標本，采用免疫組化SP法檢測Fas、Caspase-8的表達。結果在低級別膠質瘤(LGG，Ⅰ～Ⅱ級)和高級別膠質瘤(HGG，Ⅲ～Ⅳ級)中，Fas陽性率分別為60.6%(20/33)和91.4%(32/35)，Caspase-8的陽性率分別為81.8%(27/33)和48.6%(17/35)。膠質瘤病理分級越高，Fas的陽性率越高(χ2=8.968，P=0.003<0.05)，Caspase-8的陽性率越低(χ2=8.221，P=0.004<0.05)。膠質瘤的惡性程度與Fas的表達呈正相關(rs=0.536，P<0.001)，與Caspase-8的表達呈負相關(rs=-0.348，P<0.01)。結論膠質瘤細胞可對Fas系統誘導的凋亡產生耐受，Caspase-8功能的下降與膠質瘤的發生和發展密切相關。

膠質瘤；Fas；Caspase-8；免疫組化

膠質瘤是顱內最常見的原發腫瘤，呈浸潤性生長，嚴重威脅患者的生命健康。目前膠質瘤的發病機制還不十分清楚，有證據顯示膠質瘤的發生發展與細胞凋亡密切相關[1-3]。Fas是一種死亡受體，凋亡蛋白酶-8(Caspase-8)是細胞凋亡過程中起關鍵作用的凋亡蛋白酶，它們介導了多種細胞的凋亡。研究表明，Fas和Caspase-8與膠質瘤的發生和發展密切相關[4]，但目前同時檢測二者在膠質瘤中的表達并探討其相互作用的研究相對較少。本研究對68例膠質瘤組織及15例正常腦組織中Fas和Caspase-8的表達進行了檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取瀘州醫學院附屬醫院神經外科2010年6月至2013年5月經手術證實的膠質瘤病例68例(均為初發病例，首次手術，術前均未接受放療和化療)，其中男性32例，女性36例，年齡4～79歲，平均49.8歲。年齡<20歲6例，20～50歲26例，>50歲36例，所有標本均經病理組織學檢查確診，參照2000年WHO神經系統腫瘤分類和分級標準：低級別(LGG，Ⅰ～Ⅱ級)33例(其中彌漫性星形膠質細胞瘤16例，纖維性星形細胞瘤10例，毛細胞星形細胞瘤2例，少突膠質細胞瘤5例)，高級別(HGG，Ⅲ～Ⅳ級)35例(其中間變性星形膠質細胞瘤16例，膠質母細胞瘤19例)。另取15例因重型顱腦外傷行內減壓術切除的創傷周邊相對正常的腦組織作為對照組。

1.2 主要試劑和儀器鼠抗人CD95單克隆抗體(Bioworld公司)；兔抗人Caspase-8單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；組織切片機(美國Thermo公司)；普通光學顯微鏡(Motic BA200型)；Image-Pro Plus軟件系統(美國MEDIA CYBERNETICS公司)；電熱恒溫培養箱(WK891型)。

1.3 Fas、Caspase-8蛋白表達水平采用免疫組化SP法檢測Fas、Caspase-8蛋白表達水平。所有標本取材后制成連續石蠟切片。膠質瘤標本進行HE染色，確定病理分級。用二甲苯及酒精脫蠟脫苯，EDTA溶液進行抗原修復，一抗孵育30 min，水洗2～3 min，加入TBS緩沖液，二抗孵育30 min，水洗2～3 min，再加入TBS緩沖液，DAB顯色劑顯色，蘇木素復染。以TBS代替一抗作陰性對照。在切片染色均勻的腫瘤區域隨機取5個高倍視野(400×)，共計500個細胞，按染色強度(Staining intensity，SI)和陽性細胞百分率(Percentage of positive cells，PP)的乘積計算免疫反應評分(Immunoreactive score，IRS)，IRS=SI×PP。SI計分：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。PP計分：無陽性細胞0分，陽性細胞率≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。IRS表達強度判斷：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.4 統計學方法統計軟件為SPSS11.5軟件包，其中定性資料采用卡方檢驗，組間比較采用等級資料秩和檢驗，樣本表達與膠質瘤病理分級之間的關系采用Spearman秩相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Fas在不同級別膠質瘤中的表達免疫組化染色顯微鏡下觀察可見，Fas主要表達在細胞膜和細胞質，陽性表達為胞質或胞膜呈棕黃色或黃色(圖1)。Fas在膠質瘤組織中的陽性率為76.5%(52/68)，其中在低級別膠質瘤和高級別膠質瘤中的陽性率分別為60.6%(20/33)和91.4%(32/35)，而在正常腦組織中的陽性率為20.0%(3/15)。Fas表達陽性率隨膠質瘤惡性程度的增強而增高(χ2=8.968，P<0.01)，低級別膠質瘤組織Fas陽性率顯著高于正常腦組織(P< 0.01)，高級別膠質瘤組織中Fas陽性率也顯著高于低級別膠質瘤組織(P<0.01)和正常腦組織(P<0.001)，Fas的表達與膠質瘤的惡性程度呈正相關(rs=0.536，P<0.001，表1)。

圖1 Fas在膠質瘤中的表達（免疫組化×400）

表1 Fas在不同級別膠質瘤中的表達(例)

2.2 Caspase-8在不同級別膠質瘤中的表達免疫組化染色顯微鏡下觀察可見，Caspase-8主要表達在細胞質，陽性表達為胞質呈淡黃色或黃色(圖2)。Caspase-8在膠質瘤組織中的陽性率為64.7%(44/ 68)，其中在低級別膠質瘤和高級別膠質瘤中的陽性率分別為81.8%(27/33)和48.6%(17/35)，而在正常腦組織中的表達為20.0%(3/15)。Caspase-8表達陽性率隨膠質瘤病理分級的增強而降低(χ2=8.221，P< 0.01)，低級別膠質瘤組織Caspase-8陽性率顯著高于高級別膠質瘤組織(P<0.01)和正常腦組織(P<0.001)，高級別膠質瘤組織與正常腦組織相比差異無統計學意義(P=0.059)，Caspase-8的表達與膠質瘤的惡性程度呈負相關(rs=-0.348，P<0.01，表2)。

圖2 Caspase-8在膠質瘤中的表達（免疫組化×400）

表2 Caspase-8在膠質瘤中的表達(例)

3 討論

近年來膠質瘤的發病率逐步增高，在成年人中的發病率約為6/10萬，5年存活率為20%～30%[5-6]。目前雖然在膠質瘤的手術治療、化學治療、放療等方面取得了一定的進展，基因治療也在積極的研發中，但總的療效仍不能令人滿意，高級別膠質瘤尤其是膠質母細胞瘤的中位生存期仍然徘徊在12～14個月[7]。因此，有關膠質瘤發病機制的研究始終都占有重要的地位，細胞凋亡是其中的一個研究熱點問題。Fas是一種死亡受體，屬于腫瘤壞死因子受體家族和神經生長因子受體家族，與其配體FasL結合后，配體化的Fas通過其死亡結構域與適配體(Fas-associated death domain protein，FADD)肽鏈C端的死亡結構域交連，從而使FADD募集在Fas上，FADD的N端含有死亡效應結構域，可以集聚細胞凋亡蛋白酶-8酶原，繼而共同形成凋亡誘導信號復合物(Death inducing signaling complex，DISC)使Caspase-8活化，導致一系列凋亡蛋白酶活化，最終引起細胞凋亡。

既往有關膠質瘤與Fas系統的研究多局限于Fas及其配體FasL的表達以及二者之間的相互作用，對激動Fas后的下游通路研究較少。本研究著重探討Fas的表達與其下游通路上的Caspase-8的表達之間的關系，進而研究Fas激活與細胞凋亡之間是否存在必然聯系。林寧等[8]報道，Fas的表達隨著腫瘤級別的增高而逐步增多，與本實驗的結果一致，提示腫瘤細胞對Fas系統誘導的細胞凋亡可產生耐受或Fas系統的下游可能有導致細胞增殖的信號通路。國外有學者[9]報道Fas基因突變導致Fas表達產生多種變化，例如Fas在細胞表面表達的下調[10]、高水平的抗凋亡蛋白等。Chen等[11]研究顯示在小鼠卵巢癌和肝癌模型中Fas通過下游通路JNK和c-Jun誘導腫瘤生成，提示Fas通路可能有致瘤活性，抑制Fas通路的活性而不是促進其活性可作為腫瘤治療的研究方向。Caspase-8基因也可發生多種遺傳學改變，如基因缺失、點突變、甲基化，從而阻斷了凋亡蛋白酶系的級聯反應，導致凋亡受阻。Liu等[12]在A431人類腫瘤細胞系中發現Caspase-8第二個死亡效應結構域區leu62缺失，導致突變的Caspase-8不能形成寡聚體與FADD相互作用，使凋亡信號通路受阻。有報道顯示在人類視網膜母細胞瘤細胞系中，Caspase-8基因因甲基化而導致基因沉默，從而使Caspase-8表達下降，進而引起凋亡受阻[13]。在轉移性神經母細胞瘤中Caspase-8的表達被抑制，而重建Caspase-8的表達可以抑制腫瘤的生長[14]。Yamaguchi等[15]利用腺病毒載體在肝癌HCC細胞系中提高Caspase-8的表達，發現提高Caspase-8的表達可以下調抗凋亡蛋白如Bcl-xL的表達，促進細胞色素C的釋放，通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，這些研究結果都表明Caspase-8功能的下降與腫瘤的發生和發展密切相關。

綜上所述，腫瘤細胞可對Fas/FasL系統誘導的凋亡產生耐受，Caspase-8基因的突變可導致其功能的下降或缺失，研究調控Caspase-8的相關機制，探討選擇性調節Fas/Fas L系統誘導細胞凋亡或增殖的機制以及與其他信號通路之間的關系將是未來研究的熱點問題。隨著分子生物學的飛速發展，必將為膠質瘤的治療提供特異性的靶點，大幅提高膠質瘤的治療效果。

[1]Sancho-Martinez I,Martin-Villalba A.Tyrosine phosphorylation and CD95:a FAScinating switch[J].Cell Cycle,2009,8(6): 838-842.

[2]Eisele G,Roth P,Hasenbach K,et al.APO010,a synthetic hexameric CD95ligand,induces human glioma cell death in vitro and in vivo [J].Neuro Oncol,2011,13(2):155-164.

[3]Konkankit VV,Kim W,Koya RC,et al.Decitabine immunosensitizes human gliomas to NY-ESO-1 specific T lymphocyte targeting through the Fas/Fas ligand pathway[J].J Transl Med,2011,9:192.

[4]Leon-Bollotte L,Subramaniam S,Cauvard O,et al.S-nitrosylation of the death receptor fas promotes fas ligand-mediated apoptosis in cancer cells[J].Gastroenterology,2011,140(7):2011-2018.

[5]Okamoto Y,Di Patre PL,Burkhard C,et al.Population-based study on incidence,survival rates,and genetic alterations of low-grade diffuse astrocytomas and oligodendrogliomas[J].Acta Neuropathol, 2004,108(1):49-56.

[6]Goodenberger ML,Jenkins RB.Genetics of adult glioma[J].Cancer Genet,2012,205(12):613-621.

[7]Wick W,Weller M,Weiler M,et al.Pathway inhibition:emerging molecular targets for treating glioblastoma[J].Neuro Oncol,2011, 13(6):566-579.

[8]林寧,鄧家駿,付朋,等.人腦膠質瘤中Fas系統與其患者外周血中MDSC表達的相關性[J].中國臨床神經外科雜志,2011,16 (2):91-93,96.

[9]Maeda T,Yamada Y,Moriuchi R,et al.Fas gene mutation in the progression of adult T cell leukemia[J].J Exp Med,1999,189(7): 1063-1071.

[10]Bullani RR,Wehrli P,Viard-Leveugle I,et al.Frequent downregulation of Fas(CD95)expression and function in melanoma[J].Melanoma Res,2002,12(3):263-270.

[11]Chen L,Park SM,Tumanov AV,et al.CD95promotes tumour growth [J].Nature,2010,465(7297):492-496.

[12]Liu B,Peng D,Lu Y,et al.A novel single amino acid deletion caspase-8 mutant in cancer cells that lost proapoptotic activity[J].J Biol Chem,2002,277(33):30159-30164.

[13]Poulaki V,Mitsiades CS,Mcmullan C,et al.Human retinoblastoma cells are resistant to apoptosis induced by death receptors:role of caspase-8 gene silencing[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46 (1):358-366.

[14]Mckee AE,Thiele CJ.Targeting caspase 8 to reduce the formation of metastases in neuroblastoma[J].Expert Opin Ther Targets, 2006,10(5):703-708.

[15]Yamaguchi Y,Shiraki K,Fuke H,et al.Adenovirus-mediated transfectionofcaspase-8sensitizeshepatocellularcarcinomato TRAIL-and chemotherapeutic agent-induced cell death[J].Biochim Biophys Acta,2006,1763(8):844-853.

Expression of Fas and Caspase-8 in human glioma.

LIANG Xiao-yang,LIU Luo-tong,MING Yang,CHEN Li-gang. Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital to Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo explore the expression and significance of Fas and Caspase-8 in human gliomas.MethodsThe expressions of Fas and Caspase-8 were detected by SP immunohistochemistry in 68 human gliomas specimens and 15 normal brain tissues,respectively.ResultsThe positive rates of Fas in low grade gliomas(LGG,ⅠandⅡ)and high grade gliomas(HGG,ⅢandⅣ)were 60.6%(20/33)and 91.4%(32/35),respectively.The positive rates of Caspase-8 were 81.8%(27/33)and 48.6%(17/35)in the LGG and HGG groups,respectively.The expression of Fas was associated with the clinical stage(P<0.05).The expression of Fas was positively correlated with the glioma grade(P<0.001).However,the expression of Caspase-8 was negatively correlated with the glioma grade P< 0.01).ConclusionGliomas cells may have the tolerance to the apoptosis induced by Fas,the decrease in the function of Caspase-8 was closely related to the occurrence and development of glioma.

Glioma;Fas;Caspase-8;Immunohistochemistry

R730.264

A

1003—6350(2014)07—0947—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.07.0368

2013-10-29)

陳禮剛。E-mail：chengligang.cool@163.com