綠色熒光蛋白的原核表達和純化及鑒定的實驗設計與實踐

王青松，胡曉倩

（北京大學生命科學學院 生物基礎教學實驗中心，北京 100871）

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一種在美國西北海岸生長的名為Aequorea victoria的維多利亞水母中發現的蛋白質。GFP全長共238個氨基酸，分子量約為27kDa，它的發光核心是由第65至67個氨基酸（絲氨酸－酪氨酸－甘氨酸）殘基組成的結構域，可自發地形成一種熒光發色團，在波長395 nm的紫外光激發下可產生綠色熒光［1－4］。自1962年日裔科學家下村修在維多利亞水母中發現綠色熒光蛋白至今，GFP已經廣泛應用于蛋白質表達純化、蛋白質相互作用、蛋白質細胞內定位示蹤和模式生物轉基因等生物學研究中［5－8］。

SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）對蛋白質進行電泳分離，是生物學研究中廣泛使用的實驗技術。蛋白質免疫印跡技術（western blotting）是利用抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的經典的對復雜體系中靶蛋白定性和半定量的技術，蛋白質經高分辨率SDS－PAGE分離并將蛋白質轉印到膜上進行免疫化學分析，在生物學研究中廣泛使用［9－11］。蛋白質質譜分析技術自2002年獲諾貝爾化學獎以來的10多年時間里飛速發展，在蛋白質鑒定、定量和翻譯后修飾分析方面發揮了非常關鍵的作用，是現代生物學研究中的前沿實驗技術［12－13］。為提高學生的實驗技能，本實驗選擇GFP作為實驗對象，設計包括GFP的原核蛋白表達、鎳柱親和純化、熒光光譜分析、SDS－PAGE電泳分離、免疫印跡和質譜鑒定等內容的生物化學綜合實驗，增強實驗的綜合性和研究性。

1 實驗材料與試劑

鎳親和介質購自美國GE Heathcare公司；Blue plus蛋白質相對分子質量標準購自北京全式金生物技術有限公司（包含6種已知相對分子質量的標準蛋白質，16kDa～94kDa）；兔抗GFP多克隆抗體在中國科學院動物所制備；羊抗兔二抗購自北京集思佳揚生物科技有限公司；NaCl、KCl、Tris、glycine、乙醇、甲醇、磷酸、SDS、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O 和碳酸氫銨購自北京化學試劑公司；脫脂奶粉購自內蒙古伊利集團；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；考馬斯亮藍G－250、Tween－20和胰蛋白酶購自美國 Merck公司；PVDF膜購自美國Bio－rad公司；胰蛋白胨、酵母提取物、咪唑、IPTG、乙腈和甲酸購自美國Sigma公司。

2 實驗儀器

恒溫搖床（北京北方同正生物技術發展有限公司）；臺式低速離心機（上海菲恰爾分析儀器廠）；玻璃層析柱（內徑1cm×長10cm，自制）；蛋白核酸檢測儀及記錄儀（美國GE Heathcare公司）；Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數儀（美國ThermoFisher公司）；SE250小型垂直板電泳槽及電源（美國GE Heathcare公司）；凝膠成像儀（法國Vilber Lourmat公司）；脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；金屬浴（北京金銀杏生物科技有限公司）；Trans－Blot Turbo蛋白轉印系統（美國Bio－rad公司）；LTQ Orbitrap質譜儀（美國ThermoFisher公司）。

3 實驗方法

3.1 搖菌/誘導表達

從－80℃保存的含有pET28a－GFP質粒的表達菌種中挑取少量碎冰菌屑，接種于含有7mL的LB液體培養基（10g/L 胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，10 g/L氯化鈉，100mg/L卡那霉素）的小試管中，37℃搖床200r/min培養過夜；取2mL過夜培養的菌液放入500mL的LB培養基的培養瓶中，搖床200r/min培養至OD600值為0.8時加入終濃度為100mg/L的IPTG，放入37℃中6h誘導GFP的表達。

3.2 裂解提取

將誘導表達GFP后的菌液在4℃、7 000 g離心20min，棄去上清后，加入40mL的裂解緩沖液（30 mmol/L Tris，10mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5），放入－80℃冰箱2h以上；取出融化后用超聲破碎菌體，超聲10s、停5s，超聲30次后放置5 min，再次超聲30次。于20 000 g、4℃離心20min后取上清。

3.3 鎳柱親和純化

使用裂解緩沖液（30mmol/L Tris，10mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5）平衡鎳柱5個柱體積后開始上樣；上樣后用裂解緩沖液洗2～5個柱體積洗去雜蛋白；然后用含有30mmol/L咪唑的緩沖液（30 mmol/L Tris，30mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5）洗雜蛋白2～5個柱體積；最后用含有250mmol/L咪唑的洗脫緩沖液（30mmol/L Tris，250mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5）洗脫至紫外吸收峰走平為止；收集洗脫液，用10kDa的50mL的Millipore超濾離心管超濾除去咪唑，將溶液置換為30mmol/L的Tris緩沖液（pH 8.5），分裝凍存于－80℃［9］。

3.4 熒光光譜掃描分析

利用Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數儀測定純化后GFP的激發光波長與發射光波長。將100μL的GFP溶液（質量濃度2g/L）加入96孔板中，放入多功能讀數儀，選擇熒光連續光譜掃描方式。首先固定激發波長為470nm，設置掃描發射波長范圍為470～600nm，掃描波長間隔為2nm，運行發射光掃描，得到最佳發射光檢測波長。根據檢測結果固定最佳發射光波長，再進行激發光譜掃描，設置掃描激發波長范圍300～500nm，掃描波長間隔為2nm，運行激發光掃描，得到最佳激發光檢測波長。根據檢測結果可得到GFP樣品的激發光譜與發射光譜。

3.5 SDS－PAGE凝膠電泳

配制5%的濃縮膠和12.5%的分離膠。上樣后樣品進入濃縮膠時的電壓為100V；待樣品進入分離膠后，將電壓調為150V，待指示染料遷移至下沿約1cm處停止電泳；電泳后，將凝膠取出，把凝膠分為兩部分，分別用于考馬斯亮藍染色和蛋白轉印。將一部分凝膠放入容器中，加入考馬斯亮藍G－250染色液（0.01%考馬斯亮藍G－250，5%乙醇，8.5%磷酸），搖床溫和振蕩，染色1h。染色完畢，傾出染色液，用水漂洗數遍凝膠，再加入脫色液（0.25mol/L KCl）。其間更換2～3次脫色液，直至凝膠的藍背景褪去、蛋白質帶清晰為止［9－10］。

3.6 Western blotting

將SDS－PAGE凝膠電泳分離蛋白質的另一半凝膠用蛋白質轉印系統將蛋白質半干轉印到PVDF膜上。將用轉膜緩沖液（2.9g/L glycine，5.8g/L Tris，0.37g/L SDS，20%甲醇）浸透的凝膠和濾紙按照由下而上按順序擺放（濾紙、PVDF膜、膠、濾紙），形成4層轉印體系，設置20V、1.0A、20min；用含有5%脫脂奶 粉 的 PBST 溶 液 （8g/L 的 NaCl，3.6g/L 的Na2HPO4·12H2O，0.24g/L 的 KH2PO4，0.2g/L的 KCl，0.1%的 Tween－20，pH 7.4）室溫封閉1h。一抗為兔抗GFP多克隆抗體，用含有5%脫脂奶粉的PBST按照1∶3 000稀釋。用稀釋后的一抗4℃孵育過夜后用PBST洗滌10min，重復3次。羊抗兔二抗用含有5%脫脂奶粉的PBST按照1∶5 000稀釋，室溫孵育1h。PBST洗滌10min，重復3次后，DAB法顯色。待清晰的條帶出現后，用dH2O洗膜2次。

3.7 膠內酶切與質譜鑒定

將SDS－PAGE凝膠上的GFP條帶切割到EP管內，加入脫色液（25mmol/L的碳酸氫銨，50%的乙腈）；待條帶上的顏色脫干凈后，吸去脫色液，每孔加入100μL無水乙腈脫水30min后棄去乙腈；加入約10 ng胰蛋白酶（2.5ng/μL稀釋于25mmol/L碳酸氫銨中），4℃吸漲約45min，37℃酶解12～16h；加入100 μL含有0.1%TFA、50% 乙腈的萃取液，37℃搖床搖晃萃取肽段1h，使用抽干機抽干肽段13。肽段用10 μL、0.2%的甲酸溶解，使用 LTQ Orbitrap質譜儀進行分析鑒定，納升液相以乙腈－0.1%甲酸為流動相，乙腈由0min的5%梯度升至30min的35%進行肽段洗脫，流速為500nL/min。

4 結果

4.1 鎳柱親和純化GFP層析圖譜

將綠色熒光蛋白CDS序列連入到帶有6×His標簽的載體上構建pET28a－GFP表達載體，在原核大腸桿菌BL21中表達后使用鎳柱親和純化GFP蛋白。層析洗脫后有特異的親和洗脫峰流出，層析后得到的GFP蛋白有明顯的綠色熒光，表明得到了較純的GFP蛋白（見圖1）。

4.2 熒光光譜掃描分析圖譜，標出吸收峰

GFP最大的特點是具有熒光發光基團，熒光光譜分析表明，純化的GFP蛋白的最大激發波長480nm，最大發射波長500nm，與已知的GFP的熒光光譜基本相同（見圖2）。

圖1 原核表達GFP蛋白的層析圖譜

圖2 純化得到的GFP蛋白的熒光光譜掃描分析

4.3 利用電泳圖譜計算GFP的相對分子質量

利用SDS－PAGE凝膠電泳對GFP蛋白進行分離及考馬斯亮藍G－250染色，通過蛋白質條帶觀察到親和純化GFP的效果好，并經過計算得到GFP的相對分子質量約為27kDa，與理論值吻合，見圖3（a）。

4.4 Western blotting免疫印跡圖譜

Western blotting免疫印跡實驗通過蛋白轉印儀將GFP蛋白從SDS－PAGE凝膠上轉印到PVDF膜上后，經過一抗和二抗反應后，使用DAB方法對GFP條帶進行顯色。結果表明，免疫印跡膜上具有很特異的GFP蛋白條帶，表明GFP蛋白的表達和純化成功，見圖3（b）。

4.5 GFP蛋白的質譜鑒定結果

質譜鑒定實驗通過將GFP蛋白條帶從SDSPAGE凝膠上切割下來，經過脫色、脫水及胰蛋白酶酶切后得到肽段，使用LC－MS/MS質譜進行蛋白質質譜鑒定。結果表明，鑒定到19個GFP蛋白的肽段，序列覆蓋率為74.37%（見圖4）。

圖3 純化得到的GFP蛋白的SDS－PAGE電泳和免疫印跡結果

圖4 GFP蛋白的LC－MS/MS質譜鑒定結果

5 結論

（1）本實驗從綠色熒光蛋白的原核蛋白表達、鎳柱親和純化到純化的GFP蛋白的免疫印跡和LCMS/MS質譜鑒定，是學習蛋白表達、純化與鑒定的綜合性實驗，內容完整，是一個很好的綜合性實驗。

（2）實驗對象（綠色熒光蛋白）是生物學研究中的重要工具，實驗過程中能加強學生對GFP發現發展的歷史及其在生物研究中的相關應用的學習和理解。

（3）鎳柱親和純化蛋白質、SDS－PAGE凝膠電泳及Western blotting免疫印跡實驗是生物學研究中廣泛使用的重要實驗技術，通過實驗，能讓學生全面完整地掌握這些常用的實驗技術，學習各種生化儀器的使用。

（4）蛋白質質譜鑒定是現代生物學研究中研究生物大分子的重要前沿技術。由于質譜儀器昂貴，該實驗的質譜分析部分利用北京大學生命科學學院質譜測試平臺完成。該實驗內容屬于提高實驗，使本科生有機會接觸到前沿的生物學實驗技術，開拓學生的視野，提高參加科學研究的興趣。

該綜合實驗適應新形勢下實驗教學的需要，在原有生物化學實驗的基礎上，密切結合當前的生物學研究，并利用北京大學生命科學學院特色科研平臺的優勢，對現有實驗內容進行改革和創新，對于開展具有自我特色和創新的生物化學綜合實驗教學具有重要意義。

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