表面增強拉曼光譜檢測系統在實驗教學中的應用

吳寶平，曲 典，王 燕，陶 薔，劉文艷，滿梓焱

（首都醫科大學 生物醫學工程學院，北京 100069）

為了充分發揮科研儀器的功能和使用率，提高教學質量和科研水平，很多學校都在探討將科研儀器設備與本科實驗教學相結合的方法［1－3］。隨著科學技術的發展，新的檢測技術逐步應用于臨床診斷和治療，醫學院校的學生需要掌握這些技術和手段。因此將一些科研成果轉化為具體的實驗內容不僅可以培養學生的創新思維能力，而且能提高高校科研儀器的利用率，無疑是一個非常值得探索和研究的課題。本文以表面增強拉曼光譜（surface－enhanced Raman spectroscopy，SERS）檢測技術為例，設計了一些適合本科生的創新性研究實驗，使學生能在基礎學習階段就能開展帶有課題研究性質的實驗，提高科研工作能力和科學素養。

1 表面增強拉曼光譜檢測技術在癌癥早期診斷中的應用

拉曼散射是一種分子受光子激發的非彈性散射現象，拉曼光譜表征了化學物質的分子結構特性，成為識別鑒定未知化學物的有效方法。隨著光學、電子學和半導體技術的發展，拉曼光譜技術的潛力得以充分展示。近年來，納米技術的進步及應用給拉曼光譜提供了更多的應用領域。實驗表明，拉曼光譜檢測靈敏度隨基底表面納米顆粒尺度減小而增強，尤其在基底表面納米顆粒尺度小于100nm情況下，檢測靈敏度的增強效應尤為顯著［4］。

本實驗室是醫學院校生物醫學工程專業的科研實驗室，所采用的拉曼光譜檢測系統為RamTracer－200便攜式表面增強拉曼檢測系統，如圖1所示。該系統應用現代納米技術對基底進行表面處理，大大提高了檢測靈敏度和精度，檢測限提高了4～10個數量級，實現了對痕量被檢物的測量［5］。近5年來，實驗室采用此拉曼光譜檢測系統，并結合相應的數據處理方法，在利用唾液進行癌癥早期的檢測技術取得了大量的研究成果，并有望應用于臨床的早期診斷［6－8］。圖2為正常人和肺癌患者唾液的SERS平均光譜圖，圖中可以發現拉曼光譜數據量大，兩組峰重合度很高，不易于直接分辨，分別采用支持向量機算法和隨機森林算法進行分類研究，得到了較好的分類效果［9］。

圖1 RamTracer－200便攜式表面增強拉曼檢測系統

圖2 肺癌患者與健康人唾液的平均拉曼光譜圖

2 本科生實驗教學的設計

上述研究成果表明，拉曼光譜檢測技術在癌癥早期診斷中將有很好的應用，但除了需掌握拉曼光譜儀的實驗方法外，還需要進一步對統計學以及信號處理方面的深入研究工作，這對于剛剛進入大學學習的本科生，尤其是基礎醫學專業的學生有一定的難度。

本實驗室的拉曼光譜檢測系統屬于便攜式檢測系統，結構簡單清晰，便于學生了解實驗裝置的組成和工作原理，同時配合納米芯片可完成固體、液體材質的樣品檢測。本文根據拉曼光譜檢測系統的特點，設計了一組適合于低年級學生的入門實驗。用于本科生第二課堂和七年制科研訓練小組的學習和研究。

2.1 拉曼光譜認識實驗

認識實驗的目的是使學生學習拉曼光譜光譜儀的使用，同時掌握拉曼光譜儀的檢測原理。

2.1.1 認識實驗前的準備

由于不是傳統型教學實驗，我們把認識實驗分成了兩部分：見習觀摩和認識實驗。見習觀摩主要是在研究生進行實驗時，讓參與項目的本科生觀摩實驗過程，包括實驗數據處理過程。這一階段要求見習的本科生了解拉曼光譜檢測系統的結構和檢測步驟。

觀摩實驗后，要求學生查閱文獻，進一步了解拉曼光譜檢測技術在各個領域的應用，指導學生選擇認識實驗的樣品。

2.1.2 認識實驗樣品的選擇

認識實驗的樣品應具有易于引起學生學習興趣和實驗結果易于分析處理的特點。學生在查閱文獻后，發現拉曼光譜不僅在醫學研究中有越來越廣泛的應用，在食品安全、寶石鑒定中都有很好的應用。結合學生的興趣和實驗結果處理的難易程度，最后確定認識實驗的樣品為相對價值較低的市售水晶制品。

2.1.3 認識實驗的過程控制

認識實驗以掌握實驗儀器使用方法為主，因此實驗過程的控制尤為重要。拉曼光譜的實驗首先要進行乙腈校正，然后還要進行顯微聚焦和功率的選擇。為了說明上述問題，在實驗過程中，指導學生在同一樣品上，選取不同的位置和不同的功率觀察實驗數據，分析功率變化對實驗結果的影響。

2.2 拉曼光譜的應用實驗

應用實驗的設計側重于基于檢測系統自帶軟件的數據后處理過程。

2.2.1 應用實驗樣品的選擇

由于在后期的實驗中會涉及到血清、唾液等生物樣品的檢測，同時前期學生文獻調研后對食品安全方面的研究比較感興趣，因此應用實驗的樣品選用了不同材質的食用油，比如市售菜籽油和橄欖油。

2.2.2 應用實驗的數據處理

實驗數據處理采用RamTracer－200便攜式表面增強拉曼檢測系統自帶的處理軟件，主要包括基線處理和歸一化處理兩部分。在軟件講解中，對基線處理和歸一化在研究工作中的作用也作相應的介紹，使學生對于科研工作方法有更深入的了解。在這部分實驗中要求學生掌握基線處理和歸一化處理的方法，并對所測數據進行處理和分析。由于使用實驗中的數據進行處理是實驗的主要內容，在要求學生分析結果時也要指導學生對整個實驗過程進行分析，研究實驗數據的合理性和科學性。

2.3 拉曼光譜的科研實驗

上述2個實驗主要是針對本科基礎醫學專業低年級學生開展的實驗，側重于培養學習興趣，鍛煉動手能力。對于七年制臨床醫學專業和生物醫學工程專業的高年級學生則根據實驗室研究工作進展情況，安排他們參與實驗室的科研實驗。

2.3.1 生物樣品的采集和制備

本實驗室主要檢測的是唾液、血清等生物樣品，這些樣品的采集和制備都有嚴格的要求［5］。實驗前的樣品準備是實驗成敗的關鍵。前期樣本采集需要在臨床醫院進行，學生需要去醫院監督采集過程的規范性并整理病人的病歷。在實驗室，樣本需要經過離心處理后，取上清液到納米芯片上進行實驗。

為了便于學生分析處理，特意設計了對吸煙人群的拉曼光譜分析實驗，學生分別采集不吸煙、少量吸煙和大量吸煙的人群的唾液作為樣本進行實驗，并于前期實驗室關于吸毒/戒毒數據［10］進行對比分析。

2.3.2 實驗結果的分析

獲得實驗數據并進行初步的去基線、歸一化處理后，將進行數據分析。目前實驗室主要采用的高維小樣本數據的分析方法，對于大批量數據需要進行分類和主成分分析，學生可以在R軟件或Matlab軟件中完成處理工作。結合分類結果，還可以對光譜圖的進行圖譜分析，查找特征峰。

3 實踐效果

上述實驗是在本科生第二課堂及科研訓練中完成，因此并不完全拘泥于形式，實驗過程以檢測系統的操作手冊為主，并結合文獻進行數據分析。

3.1 培養了學生的研究興趣

在認識實驗中，實驗室提供了3種水晶制品：黃晶、粉晶和灰晶，也有學生帶自己的水晶制品。實驗中學生觀察譜線的特點。由于水晶制品質量的不同以及檢測功率的不同，我們指導學生做了定性的分析。有興趣的學生還帶來翡翠等其他寶石類制品進行觀察研究，達到了認識實驗的目的。

在應用實驗中，學生也集思廣益，提出檢測多種樣品，比如牛奶、飲料等。但考慮到目前市售牛奶多為合格產品，可能不含有三聚氰胺或含量較低，因此在完成指定實驗內容后，指導學生做了相應的檢測實驗并結合文獻［5－9］分析了處理后的數據。

3.2 提高了學生的科研能力

在整個實驗設計中，我們突出了研究方法的學習，使學生不僅掌握了一種實驗儀器，也學習了科學研究的方法和過程。從學生進入實驗室開始，就指導學生進行文獻查詢；在實驗過程中也充分尊重學生的實驗思路，以啟發和鼓勵為主，盡可能地幫助學生設計一個科學合理的實驗過程；后期的數據處理和分析也是一個完整的科研訓練不可缺少的部分，圖3為學生檢測和處理后的數據圖。

圖3 學生食用油實驗數據與去基線處理結果

3.3 構建教學科研互動平臺

在上述實驗后，臨床專業的學生掌握了一種新的檢測方法，在他們未來的工作，尤其是科研工作中將發揮一定的作用，也有利于拉曼光譜檢測技術在臨床中的推廣和應用。在此基礎上，對于生物醫學工程專業的學生，我們結合本科生畢業設計的要求，與實驗室日常的科研工作相銜接，建立了教學科研互動平臺，在掌握實驗方法和研究方法后，進一步指導學生對數據進行分析和處理，將科研內容不斷地充實到創新性實驗教學中，使科研和教學緊密結合，不斷獲得更新和提高。2008年至今，已有3位學生獲得優秀本科生畢業論文，相關的研究成果也發表了科研論文。

4 結論

我們結合實驗室已有的科研設備和研究成果，選取一些實驗過程易于控制、實驗結果易于分析的實驗內容引入到本科生的第二課堂和科研訓練過程中，探索了利用科研儀器設備進行本科生實驗的方法，達到了培養學生研究興趣、激發學生鉆研創新意識、提高學生科學素質的目的，在實踐中也取得了良好的效果。

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