運(yùn)動對Fetuin—A誘導(dǎo)的胰島素抵抗鼠骨骼肌IR和IRS1磷酸化的影響

張明軍

摘 要：為了解運(yùn)動對Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗鼠骨骼肌IR和IRS1磷酸化的影響。運(yùn)用牛fetuin-A 注射建立胰島素抵抗鼠模型。將小鼠分為一次性運(yùn)動組（Acute exercise group，AE）、8周運(yùn)動組（Exercise group，E）、安靜對照組（Control group，C）。結(jié)果：與C組比較，AE組和E組胰島素抵抗指數(shù)均非常顯著下降（P<0.01）；AE組骨骼肌IRS1（Tyr612）磷酸化非常顯著增加（P<0.01）；E組骨骼肌IR（Tyr1150）磷酸化和IRS1（Tyr612）磷酸化均非常顯著增加（P<0.01）；AE組和E組骨骼肌GLUT4mRNA表達(dá)和骨骼肌葡萄糖攝取率均非常顯著增加（P<0.01）。結(jié)果說明：運(yùn)動能夠非常顯著改善Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗，8周有氧運(yùn)動機(jī)制與增加骨骼肌IR（Tyr1150）、IRS1（Tyr612）磷酸化和GLUT4 mRNA表達(dá)有關(guān)。急性運(yùn)動與增加骨骼肌IRS1（Tyr612）磷酸化和GLUT4 mRNA表達(dá)有關(guān)。

關(guān) 鍵 詞：運(yùn)動生物化學(xué)；Fetuin-A蛋白；胰島素抵抗；IR（Tyr1150）磷酸化；IRS1（Tyr612）磷酸化；小鼠

中圖分類號：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-7116（2014）02-0141-04

Fetuin-A（又名a2-Heremans-Schmid糖蛋白，AHSG）是一種含量豐富的血清蛋白，主要由肝臟、胎盤合成，其作用廣泛，涉及胰島素抵抗的發(fā)生、血管鈣化、骨代謝和蛋白酶活性調(diào)節(jié)等[1-3]。Fetuin-A能夠抑制胰島素信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)胰島素抵抗產(chǎn)生[4-7]。血漿Fetuin-A水平與損害的葡萄糖耐受、胰島素抵抗、代謝綜合征、脂肪肝、動脈粥樣硬化和脂代謝紊亂密切相關(guān)[8-10]。運(yùn)動減體重、藥物以及飲食干預(yù)均能夠通過降低成年人[11-13]、兒童[14]Fetuin-A水平，改善胰島素抵抗。

鑒于Fetuin-A通過抑制細(xì)胞胰島素受體的酪氨酸磷酸化，影響胰島素信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致胰島素抵抗，并與全身性胰島素抵抗的發(fā)生關(guān)系密切，而運(yùn)動和減體重能夠降低血清Fetuin-A水平，改善胰島素抵抗，推測其機(jī)制可能與運(yùn)動調(diào)節(jié)Fetuin-A抑制的胰島素信號傳導(dǎo)過程有關(guān)，而胰島素信號傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵信號蛋白變化則可以解釋本機(jī)制，因此，為了在分子水平揭示運(yùn)動改善Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗作用機(jī)制，本研究擬采用高生理劑量的Fetuin-A腹腔注射實(shí)驗(yàn)鼠，建立Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型，研究胰島素抵抗的發(fā)生、骨骼肌胰島素信號傳導(dǎo)蛋白中胰島素受體（IR）、胰島素受體底物1（IRS1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的變化情況，以及運(yùn)動干預(yù)后變化特征，嘗試揭示運(yùn)動改善Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

多克隆抗IR酪氨酸磷酸化抗體（tyrosine1150）、抗IRS1酪氨酸磷酸化抗體（IRS1 tyrosine612）以及胰島素放射免疫試劑盒（Biosource）、牛Fetuin-A（純度95%）購自廈門慧嘉生物公司。

1.2 方法

1）造模和動物分組及運(yùn)動干預(yù)。

選用SPF級KM小鼠，8周齡，體重（44.52.3） g。胰島素抵抗模型制備：實(shí)驗(yàn)鼠予純度為95%的牛Fetuin-A腹腔注射，每公斤體重劑量為 0.75 mg[1]。8 h后檢測血液和各項(xiàng)生化指標(biāo)。以胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）判定Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型是否造模成功。胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=空腹胰島素（IU·L-1）×空腹血糖（mmol·L-1）÷22.5。8 h后檢測HOMA-IR，F(xiàn)etuin-A腹腔注射導(dǎo)致胰島素抵抗產(chǎn)生（Fetuin-A注射組（24.6±1.4）與對照組（11.1±1.6）比較，P<0.01）。對照組給予等量的生理鹽水。

造模成功的小鼠隨機(jī)分為安靜對照組（Control group，C）、一次性運(yùn)動組（Acute exercise group，AE）和8周運(yùn)動組（Exercise group，E）3組，每組6只。AE組和E組在跑臺上進(jìn)行有氧運(yùn)動干預(yù)，跑臺速度15 m/min，60 min/d，5 d/周，運(yùn)動強(qiáng)度約為70%～75%最大攝氧量[15]。AE組進(jìn)行1次運(yùn)動；E組運(yùn)動持續(xù)8周，同時執(zhí)行牛Fetuin-A腹腔注射，1次/d。

2）試驗(yàn)指標(biāo)檢測。

（1）禁食12 h，運(yùn)動結(jié)束后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟取血，斷頭處死后取腓腸肌組織備用?？崭寡且跃┒佳莾x檢測。放射免疫法依照說明書檢測空腹胰島素。

（2）RT-PCR法檢測GLUT4mRNA：提取總RNA，檢測RNA純度和完整性，依照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。內(nèi)參β-actin上游引物：5-AGATAG ACGT GCAC AGGAAG-3，下游引物：5-GCTGGCGAACCGCCAG AGCT-3；GLUT4上游引物5-CGTGCGTGACATTAA AGAG-3，下游引物5-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳成像，凝膠成像分析系統(tǒng)分析，待測基因的相對表達(dá)量：待測基因用β-actin表示。

（3）胰島素（10 nmol/L）刺激腓腸肌經(jīng)20 min后，液閃計(jì)數(shù)儀測定腓腸肌細(xì)胞葡萄糖攝取率（pmol/（mg·min））[17]。

（4）免疫共沉淀檢測蛋白磷酸化。各組細(xì)胞予胰島素刺激后，細(xì)胞裂解取上清。100 μg細(xì)胞溶解物SDS-PAGE蛋白分離、轉(zhuǎn)膜，予抗IR和IRS1抗體，加100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% A-Sepharose沉淀，免疫沉淀復(fù)合物洗滌，上樣緩沖液煮沸、離心，取上清，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉過夜，分別加IR和IRS1抗磷酸酪氨酸抗體，洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗；曝光，洗滌后與ECL反應(yīng)，光密度定量分析采用LeicaQ圖像分析儀（德國）。endprint

3）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組的各變量進(jìn)行單因素方差分析，LSD檢驗(yàn)。顯著性水平和非常顯著性水平分別取P<0.05和P<0.01。

2 結(jié)果及分析

2.1 胰島素抵抗性和骨骼肌GLUT4mRNA表達(dá)

胰島素抵抗指數(shù)AE組（19.1±0.8）和E組（17.8±1.5）比C組（24.8±2.4）降低，差異具有非常顯著性意義（P<0.01）。骨骼肌GLUT4mRNA表達(dá)AE組（0.73±0.20）和E組（0.70±0.20）比C組（0.37±0.10）增加，差異具有非常顯著性意義（P<0.01）。

2.2 骨骼肌IR、IRS1磷酸化和葡萄糖攝取率

與C組相比，AE組IR（Tyr1150）磷酸化增加，差異沒有顯著性意義（P>0.05）；E組IR（Tyr1150）磷酸化增加，差異具有非常顯著意義（P<0.01）；AE組和E組IRS1（Tyr612）磷酸化增加，差異都具有非常顯著性意義（P<0.01）（見圖1）。

骨骼肌葡萄糖攝取率AE組（58.9±4.1）和E組（61.7±2.2）比C組（20.1±1.2）增加，差異具有非常顯著性意義（P<0.01）。

3 討論

為了研究運(yùn)動影響Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗機(jī)制，必須制備Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型，從而排除其它致胰島素抵抗的因素干擾。參考Hennige A M[1]的研究，本研究采取牛Fetuin-A（純度95%，0.75 mg/g體重）腹腔注射的方法建立Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型，檢測模型鼠胰島素抵抗指數(shù)，比正常對照組顯著增加，F(xiàn)etuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型造模成功。

Fetuin-A在1944年被發(fā)現(xiàn)是血液中一種含量較豐富的糖蛋白，作用廣泛，主要由肝臟細(xì)胞合成并分泌到血液中[17]。最近有關(guān)Fetuin-A與肥胖、糖尿病、胰島素抵抗關(guān)系的研究成為了熱點(diǎn)。對3 710例調(diào)查對象的檢測顯示：獨(dú)立于性別、種族或心血管疾病因子，高血清Fetuin-A與老年人2型糖尿病的發(fā)病率密切相關(guān)，而且年齡超過75周歲，這種相關(guān)性的程度將更加顯著[18]。歐洲人癌癥和營養(yǎng)展望調(diào)查顯示，獨(dú)立于現(xiàn)有的其它相關(guān)風(fēng)險因素，循環(huán)Fetuin-A將預(yù)示未來7年的2型糖尿病發(fā)病幾率[19]。針對健康、老年和體成分的研究也顯示：獨(dú)立于其它胰島素抵抗的風(fēng)險因素，血清Fetuin-A 水平與隨后6年的Ⅱ型糖尿病發(fā)病幾率密切相關(guān)[8]。針對運(yùn)動、飲食干預(yù)和手術(shù)減重的研究也發(fā)現(xiàn)了Fetuin-A變化與胰島素抵抗之間的關(guān)系。322名實(shí)驗(yàn)者經(jīng)過2年的飲食干預(yù)減重后，隨著體重減輕，血清Fetuin-A水平降低，胰島素抵抗、血脂和其它代謝指標(biāo)也出現(xiàn)了良性改變[20]。而胃繞道手術(shù)后體重的減輕可以降低肥胖者血清Fetuin-A、胰島素抵抗，預(yù)計(jì)將使這些對象未來10年罹患糖尿病的幾率降低約70%[11，21]。針對胰島素信號蛋白的研究也部分揭示了Fetuin-A誘導(dǎo)胰島素抵抗機(jī)制，F(xiàn)etuin-A與IR酪氨酸磷酸酶結(jié)合，抑制胰島素信號向下游的傳導(dǎo)，導(dǎo)致胰島素抵抗的產(chǎn)生[17]。重組Fetuin-A孵育的纖維母細(xì)胞中胰島素刺激的IR自磷酸化被抑制了80%，胰島素刺激的IR亞單位的酪氨酸磷酸化被抑制了40%，出現(xiàn)胰島素抵抗。

本研究中模型鼠在接受了Fetuin-A腹腔注射后，出現(xiàn)嚴(yán)重的胰島素抵抗，隨即分別給予一次急性運(yùn)動和8周有氧運(yùn)動干預(yù)，結(jié)果顯示：急性運(yùn)動組和8周有氧運(yùn)動組鼠的胰島素抵抗指數(shù)分別比安靜對照組非常顯著降低（P<0.01）。提示急性運(yùn)動和8周有氧運(yùn)動均能夠改善Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗，但是其中機(jī)制尚不清楚。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與安靜對照組比較，急性運(yùn)動組免疫共沉淀法檢測的骨骼肌IR（Tyr1150）磷酸化未發(fā)生顯著變化（P>0.05），IRS1（Tyr612）磷酸化則非常顯著增加（P<0.01）（見圖1）。而8周有氧運(yùn)動組則呈現(xiàn)了與急性運(yùn)動組不同的變化特征，與安靜對照組比較，運(yùn)動組骨骼肌IR（Tyr1150）和IRS1（Tyr612）磷酸化均非常顯著增加（P<0.01）（見圖1）。作為胰島素信號傳導(dǎo)的效應(yīng)，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)功能蛋白GLUT4承擔(dān)著葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，協(xié)助將葡萄糖攝取入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究中，與安靜對照組比，急性運(yùn)動組和8周有氧運(yùn)動組RT-PCR法檢測的骨骼肌GLUT4mRNA表達(dá)和液閃儀測定的骨骼肌葡萄糖攝取率均呈現(xiàn)了相似的非常顯著增加趨勢（P<0.01）。

綜上所述，F(xiàn)etuin-A對骨骼肌胰島素信號蛋白IR和IRS1均產(chǎn)生了抑制作用，誘導(dǎo)了胰島素抵抗的產(chǎn)生，研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致。運(yùn)動則能夠改善Fetuin-A胰島素抵抗，機(jī)制與運(yùn)動解除了Fetuin-A 對IR和IRS1的抑制有關(guān)，但是急性運(yùn)動和8周有氧運(yùn)動的具體作用位點(diǎn)呈現(xiàn)差異，即急性運(yùn)動僅僅能夠解除IRS1（Tyr612）磷酸化的抑制，而8周有氧運(yùn)動則能夠解除IR（Tyr1150）和IRS1（Tyr612）磷酸化的雙重抑制。運(yùn)動恢復(fù)了Fetuin-A影響的胰島素信號傳導(dǎo)功能，最終增加了骨骼肌GLUT4mRNA的表達(dá)，使得骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取功能增強(qiáng)，改善了胰島素抵抗。

本研究的不足之處在于僅僅分析了骨骼肌胰島素信號蛋白中IR和IRS1磷酸化變化情況，而Fetuin-A對胰島素抵抗的影響必然涉及大量信號蛋白和相關(guān)調(diào)節(jié)酶，因此本研究也必然存在較大的局限性，有待于在后續(xù)的研究中不斷補(bǔ)充和完善。

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