PCR 直接測(cè)序法在膿腫分枝桿菌鑒定中的應(yīng)用

孫王偉，周燕菊，謝怡萍，沙霞，王建軍

（昆山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇昆山 215300）

·論著·

PCR 直接測(cè)序法在膿腫分枝桿菌鑒定中的應(yīng)用

孫王偉，周燕菊，謝怡萍，沙霞，王建軍

（昆山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇昆山 215300）

目的探討聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)與DNA測(cè)序技術(shù)鑒定膿腫分枝桿菌的效果。方法利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物PCR擴(kuò)增疑似分枝桿菌的16S rRNA基因的DNA片段并進(jìn)行DNA測(cè)序分析。DNA測(cè)序獲得序列經(jīng)生物信息學(xué)比對(duì)分析獲得相關(guān)分枝桿菌的信息；針對(duì)相關(guān)分枝桿菌分別設(shè)計(jì)非同源區(qū)域特異性引物對(duì)1 500 bp的克隆DNA片段擴(kuò)增驗(yàn)證。結(jié)果細(xì)菌16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增獲得約1 500 bp的DNA片段，但DNA測(cè)序僅獲得其中部分DNA序列約296 bp；部分DNA序列經(jīng)生物信息學(xué)比對(duì)分析后獲得四種同源性高達(dá)98%的分枝桿菌信息，并且四種分枝桿菌的特異性引物對(duì)1 500 bp的克隆產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增后僅在膿腫分枝桿菌中獲得特異性PCR產(chǎn)物。結(jié)論疑似結(jié)核患者體內(nèi)的抗酸染色陽(yáng)性菌為非結(jié)核分枝桿菌中的膿腫結(jié)核分枝桿菌，并且PCR直接測(cè)序法可快速鑒定細(xì)菌的種屬。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；DNA測(cè)序；16S rRNA；生物信息學(xué)；膿腫分枝桿菌

非結(jié)核分枝桿菌(Non-Tuberculous mycobacteria，NTM)是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌，而膿腫結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)屬于其中IV群的快生長(zhǎng)菌[1]。近年來(lái)NTM在我國(guó)引發(fā)了多起院內(nèi)感染，大多由于手術(shù)器械被污染、創(chuàng)口污染等導(dǎo)致暴發(fā)，而目前尚無(wú)特異高效的抗NTM藥物且NTM病治療較為棘手并且預(yù)后不佳[2]。膿腫分枝桿菌主要可導(dǎo)致患者肺部與皮膚感染，以咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、肉芽腫等癥狀為主。膿腫分枝桿菌對(duì)臨床上常用的大多數(shù)抗結(jié)核藥物均有耐藥性，且治療過(guò)程長(zhǎng)而差，因此臨床快速、準(zhǔn)確的鑒定菌種及藥敏情況分析，對(duì)疾病的治療具有關(guān)鍵作用[3]。PCR是一種以核酸生物化學(xué)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有應(yīng)用價(jià)值，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的診斷、菌種類型的鑒定有較高的靈敏度和特異性。本研究采用PCR-直接測(cè)序鑒定法，利用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物對(duì)分枝標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物后直接DNA測(cè)序，生物信息學(xué)分析確定分枝桿菌的種類。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象久治不愈疑似結(jié)核患者的痰標(biāo)本。

1.2 主要試劑正常熔點(diǎn)瓊脂糖、低熔點(diǎn)瓊脂糖和碘化丙啶購(gòu)于Sigma公司(美國(guó))，抗酸染色試劑、羅氏培養(yǎng)基和基因組DNA提取試劑購(gòu)自碧云天公司，DNA聚合酶購(gòu)自Takara公司。

1.3 抗酸染色取少量痰標(biāo)本高壓蒸汽滅菌后涂片，石炭酸復(fù)紅初染1 min，3%鹽酸酒精脫色1 min，堿性美蘭復(fù)染1 min，細(xì)水沖洗后自然晾干，高倍鏡觀察并拍照保存。

1.4 基因組DNA提取1 ml痰標(biāo)本中加入3倍體積的4%NaOH，震蕩混勻20 s，放置15 min，7 800×g離心10 min，去上清，加入生理鹽水1 ml，混勻，7 800×g離心10 min，去上清液；加入100 μl DNA提取液，100℃加熱10 min，迅速冷卻(置于-20℃冰箱)10 min，7 800×g離心2 min，0.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，其余-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以下基因的cDNA序列Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物并合成，見表1。

表1 設(shè)計(jì)合成的引物序列

1.6 16S rDNA PCR50 μ l PCR體系中含cDNA 5 μl，rTaqDNA聚合酶2.0 μl，10 mmol/L上游引物1 μl，10 mmol/L下游引物1 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，無(wú)核糖核酸酶水32 μl，10×PCR緩沖液5 μl；95℃預(yù)變性7 min，94℃變性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，72℃終延伸10 min，共30個(gè)循環(huán)，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.7 生物信息學(xué)分析PCR產(chǎn)物送北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司測(cè)序，將獲得的DNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BlastN分析比對(duì)，獲得四種同源度高達(dá)98%的分枝桿菌。利用Primer 5軟件在四種分枝桿菌的非同源區(qū)域設(shè)計(jì)并合成特異性引物，對(duì)16S rDNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.8 四種特異性引物PCR50 μl PCR體系中含模板DNA 5 μl，TaqDNA聚合酶1.0 μl，10 mmol/L上游引物1μl，10 mmol/L下游引物1μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，無(wú)核糖核酸酶水33 μl，10×PCR緩沖液5 μl；94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，54℃退火35 s，72℃延伸35 s，72℃終延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 抗酸染色取適量高壓蒸汽滅菌后的痰液抗酸染色，高倍鏡下尋找觀察抗酸染色菌，見圖1。

圖1 痰液抗酸染色結(jié)果(×1 000)

2.2 基因組DNA提取高壓蒸汽滅菌后的痰液，根據(jù)MTB DNA檢測(cè)試劑盒方法-煮沸裂解法提取抗酸分枝桿菌基因組DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，見圖2。

圖2 抗酸分枝桿菌基因組DNA電泳結(jié)果

2.3 16S rDNA PCR擴(kuò)增以抗酸分枝桿菌基因組DNA為模板，16S rDNA細(xì)菌通用基因引物PCR擴(kuò)增特異性片段并1.5%瓊脂凝膠電泳分析，見圖3。

2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果細(xì)菌16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物，純化濃縮后送北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司多次測(cè)序，僅獲得296 bp的DNA序列：

TGCAGTCGACGGAAGGCCTTCGGGGTACTCGA GTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATC TGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTG GGTCTAATACCGGATAGGACCACACACTTCATG GTGAGTGGTGGTGCAAAGCTTTTGGTGTGGGA GGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCAC ACTGGGACTGAAATACGGTCCATACTCCCTAC GGGAGGCAGCAGTGAGG

圖316 S rDNA引物PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.5 生物信息學(xué)分析測(cè)序獲得的296 bp DNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ncbi.nlm.nih.gov/ nucleotide）BlastN軟件中與微生物核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析獲得如下結(jié)果，見圖4。

圖4 296 bp DNA測(cè)序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)blastn結(jié)果

2.6 四種特異引物驗(yàn)證針對(duì)與測(cè)序獲得的四種高達(dá)98%的同源序列的非同源區(qū)域分別設(shè)計(jì)特異性引物，利用該四種引物對(duì)細(xì)菌16S rDNA通用引物的PCR產(chǎn)物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，見圖5。

圖5 四種特異性引物PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討論

傳統(tǒng)的分枝桿菌生化鑒定耗時(shí)且準(zhǔn)確性差。近年來(lái)，PCR和DNA堿基序列測(cè)定技術(shù)得到迅速發(fā)展，這兩種技術(shù)的結(jié)合為細(xì)菌的分類與鑒定提供了一種快速、準(zhǔn)確的方法[4]。16S rRNA基因被稱為細(xì)菌的活化石，為高度保守基因，其進(jìn)化速度十分緩慢，據(jù)測(cè)算1%堿基的取代需要大約50×106年，因而使其具有生物鐘的特點(diǎn)，16S rRNA基因序列具有細(xì)菌屬、種的特征，因而16S rRNA基因測(cè)序已作為細(xì)菌分類和鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。目前已知分枝桿菌的16S rRNA基因已經(jīng)全部測(cè)序。通過(guò)基因比較分析，發(fā)現(xiàn)分枝桿菌16S rRNA基因既含有屬特異的保守序列，又含有種特異性的高變區(qū)。以16S rRNA基因?yàn)榘谢颍捎肞CR-測(cè)序方法，通過(guò)序列的分析可以鑒定病原菌[6]。目前16SrRNA商品試劑盒可以成功擴(kuò)增出人結(jié)核分枝桿菌的序列，但應(yīng)用在非結(jié)核分枝桿菌中較少，本研究中用16S rRNA基因的通用引物PCR擴(kuò)增疑似結(jié)核病人痰標(biāo)本，獲得一段1 500 bp的產(chǎn)物，經(jīng)DNA測(cè)序僅獲得部分DNA序列，然而多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)序僅獲得296 bp的DNA序列，存在以下幾種可能：(1) 16S rRNA雖然是微生物基因組的通用序列，但不一定適合每一種微生物基因組片段的擴(kuò)增如膿腫分枝桿菌；(2)在測(cè)序過(guò)程出現(xiàn)某些問(wèn)題導(dǎo)致未能測(cè)出全長(zhǎng)序列。一般情況下，16S rRNA基因的通用引物PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序可獲得全部的DNA序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析可以獲得該菌種的信息，從而確定細(xì)菌的屬、種。本研究中296 bp的DNA序列經(jīng)生物信息學(xué)比對(duì)分析獲得了四種同源性高達(dá)98%的分枝桿菌，但無(wú)法具體確定患者的分枝桿菌到底是哪一種。因此，針對(duì)該四種序列與296 bp DNA序列的非同源序列設(shè)計(jì)了四種特異性引物，利用四種引物對(duì)16S rRNA擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若獲得產(chǎn)物即說(shuō)明296 bp DNA序列為四種分枝桿菌序列中的一種，也就可以確定該分枝桿菌為哪種分枝桿菌。最終，膿腫分枝桿菌特異性引物在長(zhǎng)度為1 500 bp的PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出了250 bp左右的特異性條帶。從而確定了該結(jié)核患者體內(nèi)的病原菌為膿腫分枝桿菌。

PCR和測(cè)序可以在1～2 d完成，而常規(guī)臨床分枝桿菌分離株的鑒定需要1個(gè)月時(shí)間，因此基因擴(kuò)增與測(cè)序技術(shù)鑒定分枝桿菌可以大大節(jié)約時(shí)間，使患者得到及時(shí)正確的治療。

[1]趙建宏,李雅靜,溫海楠,等.非結(jié)核分枝桿菌感染的分子診斷研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,3(11):155-158.

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Application of PCR and direct sequencing technologies in the identification of Mycobacterium abscessus.

SUN Wang-wei,ZHOU Yan-ju,XIE Yi-ping,SHA Xia,WANG Jian-jun.
Department of Laboratory,the First People's Hospital of Kunshan,Kunshan 215300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore the identification of Mycobacterium abscessus with PCR,direct sequencing approaches and bioinformatics.MethodsDNA fragments of 16S rRNA gene were acquired using PCR and DNA sequence obtained by DNA sequencing.DNA about Mycobacterium was analyzed by bioinformatics.Specific primers of non-homologous region for relevant branches Bacillus were designed respectively to clone DNA fragment of 1 500 bp product.ResultsDNA fragment of 1 500 bp was acquired with PCR,but only a part of the DNA sequence of approximately 296 bp was obtained.After DNA sequence bioinformatics analysis,four kind of Mycobacterium with homology of up to 98%were obtained.Finally,we only obtained PCR special product in M.abscessus when four kinds of spe-cific primers for Mycobacterium were used to clone the DNA fragment of 1 500 bp.ConclusionThe Mycobacterium in the suspected TB patients is M.abscessus,and species of bacteria can be identified rapidly by PCR and direct sequencing approaches.

Polymerase chain reaction;DNA sequencing;16S rDNA;Bioinformatics;Mycobacterium abscessus

R378.91

A

1003—6350（2014）22—3342—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.22.1308

2014-04-23)

昆山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：KS1347）

王建軍。E-mail：wangjianjun0520@163.com