碳納米管丙氨瑞林對人子宮內膜癌細胞裸鼠皮下移植瘤生長及對Smurf2表達的影響

王亞榮　張杏林　張三元

【摘要】 目的：觀察碳納米管丙氨瑞林對人子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤組織中轉化生長因子β1（TGF-β1）誘導的泛素化調節因子2（Smurf2）表達的影響，探討其可能的作用機制。方法：以人子宮內膜癌Hec-1-B細胞株皮下移植瘤組織作為研究對象，分別給予生理鹽水、碳納米管、丙氨瑞林、碳納米管丙氨瑞林，四種不同的干預方式，每6天1次，共5次。在干預過程中觀察腫瘤生長情況，測量腫瘤體積，干預結束利用免疫組化法（PV）檢測各腫瘤組織中Smurf2蛋白的表達。結果：碳納米管丙氨瑞林組裸鼠精神飲食情況明顯優于其他三組，體重明顯輕于其他三組。取出移植瘤體后比較，碳納米管丙氨瑞林組瘤體體積最小，與其他三組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。碳納米管丙氨瑞林干預組瘤組織中Smurf2蛋白的表達較其他三組表達增多，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：丙氨瑞林可以抑制子宮內膜癌細胞裸鼠皮下移植瘤的生長，在相同藥物劑量條件下，碳納米管丙氨瑞林作為緩釋劑可以更好地增加裸鼠體重和抑制移植瘤組織的生長，有利于減少藥物毒副作用，其作用機制可能是通過上調移植瘤組織中Smurf2蛋白來抑制腫瘤生長的。

【關鍵詞】 碳納米管； 丙氨瑞林； 子宮內膜癌； 移植瘤； Smurf2

Effect of CNTs-Alarelin on Human Endometrial Carcinoma in Nude Mice of Subcutaneous Xenograft and the Expression of Smurf2/WANG Ya-rong，ZHANG Xing-lin，ZHANG San-yuan.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：025-028

【Abstract】 Objective：To investigate the effects of CNTs-alarelin on human endometrial carcinoma in nude mice of subcutaneous xenograft by the expression of ubiquitin adjustment factor 2 （Smurf2） which inducting by the transforming growth factor β1（TGF-β1），and to explore its possible mechanism.Method：Human endometrial carcinoma models were established by subcutaneous transplantation in nude mice，and then 24 rats were randomly divided into 4 groups：control group，CNTs group，Alarelin group and CNTs-Alarelin group，respectively gave corresponding treatment，six days one time.Observed the systemic condition of the mice every day，measured the size of tumor.At end of the intervention，immunohistochemical method（PV） was used to detect various Smurf2 protein expression in tumor tissues.Result：The CNTs-Alarelin group was significantly better than the other groups，there were statistical significance（P<0.05）.It was the smallest volume that CNTs-Alarelin group，compared with other groups，and the differences were statistically significant（P<0.05）.Smurf2 protein expression in tumor tissue of CNTs-Alarelin group increased than the other three groups，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：CNTs-Alarelin can more effectively inhibit the growth of the human endometrial carcinoma in nude mice of subcutaneous xenograft.The mechanism may be related to increases Smurf2 protein.

【Key words】 Carbon nanotubes； Alarelin； Endometrial cancer； Xenografts； Smurf2

First-authors address：The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.009

丙氨瑞林是一種GnRH激動劑（GnRH-a），其生物活性是天然GnRH的15倍。持續使用GnRH-a可使垂體GnRHR被耗竭，抑制垂體功能，減少促性腺激素的分泌，從而使雌激素水平降至絕經期或略高于絕經期水平，因此他可以用于治療激素依賴性腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、子宮內膜癌等[1]。但對于其作用機制尚不明確。近年來研究發現，Smurf2是一種E3連接酶，由TGF-β1信號通路誘導的泛素化調節因子，對細胞周期的調控、腫瘤的浸潤和轉移、細胞衰老機制等方面具有重要作用[2]。碳納米管（carbon nanotubes，CNTs），是目前較先進的納米粒子之一，是現代生物醫學的研究熱點，尤其是在藥物載體方面[3-5]。本文通過比較GnRH類似物（丙氨瑞林）及其緩釋劑型（碳納米管丙氨瑞林）對人子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響和Smurf2的表達高低，來探討其作用機制，為臨床上子宮內膜癌治療提供實驗基礎及理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系和動物模型 人子宮內膜癌Hec-1-B細胞株（中國醫學科學院基礎醫學研究所），24只BALB/C nu/nu裸鼠，5～6周齡，體重為16～20 g，雌性（國家噬齒類種子中心-中國藥品生物制品檢驗所實驗動物中心，許可證號：scxk（京）2009-0017），于無特定病原體（SPF，Specific pathogen free）環境飼養、提供。

1.2 主要藥物和試劑 醋酸丙氨瑞林（alarelin acetate for injection）（上海靜融生物科技有限公司）；碳納米管、碳納米管丙氨瑞林（太原理工大學新材料工程技術研究中心）；Smurf2免疫組化試劑盒（武漢博士德生物制品有限公司）。

1.3 細胞培養 根據胰消化培養法，人子宮內膜癌細胞株Hec-1B細胞采用高糖DMEM培養基（含10%胎牛血清、100 U/mL慶大霉素等），置于CO2培養箱中進行培養（含5%CO2、PH 7.2、環境溫度為37 ℃）。消化、離心并收集處于對數期的Hec-1B細胞，制成終濃度為1.6×107/mL的單細胞Hec-1B懸液以備構建模型用。

1.4 裸鼠皮下移植瘤模型的制備及其生長狀況檢測 將24只荷瘤裸鼠（無特定病原體（SPF）環境下飼養）置于超凈臺內進行接種。碘酊局部皮膚消毒裸鼠左側腋窩皮下，一次性無菌注射器抽取子宮內膜癌細胞株Hec-1-B細胞懸液0.5 mL（約含8.0×106個細胞），注射至裸鼠皮下。連續觀察1周，待皮下成瘤直徑達0.5 cm時，將24只裸鼠隨機分為4組進行干預，每組6只，分別為生理鹽水組（即對照組）、碳納米管組、丙氨瑞林組（30 μg/kg）、碳納米管丙氨瑞林組（碳納米管的用量按丙氨瑞林劑量30 μg/kg折算），每只裸鼠每次肌肉注射0.4 mL，每6天1次，共5次，分籠飼養。實驗期間每天觀察裸鼠日?；顒忧闆r及移植瘤體的生長狀況，種植后用游標卡尺測量皮下移植瘤的長徑a和短徑b（每3天1次），計算腫瘤近似體積V（mm3）=（a×b2）/2。干預結束后處死裸鼠，完整稱取瘤體。計算腫瘤抑瘤率=[（V對照組-V實驗組）/V對照組]×100%。陽性標準為抑瘤率>15%。通過抑瘤率的比較來評估藥物對移植瘤生長的抑制作用。

1.5 病理學檢查 處死裸鼠后取新鮮瘤體，10%甲醛固定、石蠟包埋、HE染色，光鏡觀察腫瘤的病理變化。

1.6 免疫組化檢測Smurf2蛋白表達 （1）處理石蠟切片：二甲苯、100% 酒精等處理切片，10 mmol/L檸檬酸溶液微波抗原修復，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶；（2）滴加一抗（兔抗人Smurf2單克隆抗體工作液）、試劑1（Polymer Helper）、試劑2（Polyperoxidase-anti-mouse IgG）：37 ℃孵育，PBS沖洗；（3）DAB溶液顯色、鏡檢，蘇木素復染，酒精固定；（4）中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。

學校病理科醫師協助分析切片結果，Smurf2陽性細胞為胞漿出現棕黃色顆粒。（1）陽性細胞比例的判斷：在400倍視野下，每例蠟塊組織觀察3個切片，陽性細胞所占的百分比判定：0分為陰性，1分為陽性細胞10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。（2）染色強度判斷：按照分值來判定（0～3分），顏色強度依次為：無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色。（3）陽性等級的判斷：每張切片的陽性細胞比例與染色強度的乘積，大于3分以上的結果為“+”。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，各均數間比較運用方差法進行分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及裸鼠生長狀況的監測 裸鼠接種Hec-1B細胞懸液后，接種部位紅腫、形成皮丘，一周后形成圓球狀瘤體，并逐漸增大。隨著移植瘤的不斷增長，裸鼠開始出現不同程度的活動減少、食欲減退、體重下降等癥狀。不同干預組中腫瘤體積增長不同。

2.2 各組裸鼠移植瘤體積變化及對抑瘤率的影響 藥物干預前，每組間體積比較差異均無統計學意義（P>0.05）。進行藥物干預后，丙氨瑞組移植瘤體積和碳納米管丙氨瑞林組分別為（1393±405）mm3、（1017±354）mm3，抑瘤率為40%、17.82%，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。分別與碳納米管組和生理鹽水組比較，差異也均有統計學意義（P<0.05），這說明碳納米管丙氨瑞林對子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤有一定的抑制作用，且比丙氨瑞林對腫瘤的抑制作用更為顯著。而碳納米管組和生理鹽水組比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

3 討論

碳納米管（carbonnanotubes，CNTs）是納米材料的一種，目前廣泛應用于醫學生物領域中，如制作疫苗、基因載體及藥物載體等。其基本結構：兩端分別用類似半個富勒烯分子的半球狀封端，管體是由單層或復層六元碳環石墨層彎曲而成[6]。現用于藥物載體的原始CNTs，有一定的毒副作用，其大小跟細胞對碳納米管的攝取量的多少有關，而攝取量的多少又與碳納米管尺寸和濃度有關[7]。Kayat等[8]認為，CNTs的毒性與多種因素相關，如結構、功能團、制備方法等。但經過化學修飾后可有效去除其在制備過程中殘留的金屬催化劑，從而降低其毒副作用。細胞可選擇CNTs的長度和修飾基團，根據此特點，筆者可以將碳納米管修飾成不同長度、不同基團修飾的各種型號，更適用于各種疾病的藥物治療。經過功能修飾后的CNTs降低其免疫原性，增加分散性、生物相容性、在血液中的循環時間、細胞穿透性等，同時可經腎臟代謝清除[9-13]，故可作為藥物載體安全應用于臨床。

研究表明，對于激素依賴性腫瘤可以持續性地給予GnRH-a治療[14-15]。有學者認為，GnRH-a可直接影響子宮內膜上癌細胞的增殖及凋亡[16-18]。通過實驗本課題組已證實GnRH-a（丙氨瑞林）可抑制人子宮內膜癌裸鼠移植瘤不斷增長[19]。

目前，大多數研究是以化學藥物作為支撐的負載藥物，生物載體的研究并不多，并且缺乏激素類相關的抗腫瘤藥物的緩慢釋放劑制備的研究。為了實現藥物的控釋或緩釋，提高療效，降低毒副作用，關鍵是采用有效的藥物載體。碳納米管丙氨瑞林緩釋劑，不僅可以延長丙氨瑞林對裸鼠移植瘤的作用時間，而且明顯降低了高濃度藥物對裸鼠的毒副作用，這種高效、低毒、靶向給藥方式，使抗子宮內膜癌的激素藥物丙氨瑞林的療效更理想、更安全。

Smurf2在轉化生長因子-β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等信號通路中具有重要的調控作用，在細胞周期的調控、腫瘤的浸潤和轉移、細胞衰老機制等方面都有重要的影響[7]。Smurf2是通過多種途徑對TGF-β信號轉導途徑發揮負反饋調節作用[20]。本實驗在碳納米管丙氨瑞林對移植瘤抑制作用的基礎上研究Smurf2的表達。

研究結果顯示：（1）干預結束后，碳納米管丙氨瑞林組的抑瘤率最大，且與其他三組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。丙氨瑞林組次之，與生理鹽水組和碳納米組比較差異有統計學意義（P<0.05）。說明碳納米管丙氨瑞林和丙氨瑞林均可抑制子宮內膜癌裸鼠移植瘤的生長，且相同劑量下，碳納米管丙氨瑞林的抑瘤作用更顯著。生理鹽水組和碳納米管組比較差異無統計學意義（P>0.05）。（2）碳納米管丙氨瑞林組裸鼠體重較其他三組明顯增加，且組間比較差異有統計學意義（P<0.05），顯示碳納米管丙氨瑞林可以更好地抑制腫瘤的生長，與等劑量的丙氨瑞林相比，不僅可以增加裸鼠體重，還可以改善其生存環境。生理鹽水組與碳納米管組裸鼠體重比較差異無統計學意義（P>0.05），表明功能化的碳納米管對裸鼠幾乎無毒副作用。（3）碳納米管丙氨瑞組移植瘤組織中Smurf2的表達較其他三組表達明顯增高，差異均有統計學意義（P<0.05），故認為碳納米管丙氨瑞林可以抑制人子宮內膜癌細胞裸鼠移植瘤的生長，可能是通過上調Smurf2基因的表達來實現的。但因碳納米管丙氨瑞林的抗腫瘤機制是多樣化的，關于其具體作用機制、臨床運用的最佳濃度及Smurf2的調控機制有待于進一步研究。

綜上所述，與丙氨瑞林相比，碳納米管丙氨瑞林緩釋劑對子宮內膜癌的抑制作用更顯著，要達到相同治療效果，所用碳納米管載體后，丙氨瑞林的用藥總量將會大大下降，其藥物副作用將會更少，它的抑制作用可能是與Smurf2基因的表達上調有關。本實驗將為今后激素治療子宮內膜癌提供一定的臨床診療思路及理論依據，但該研究仍存在一些不足之處，未探討碳納米管丙氨瑞林的最佳用藥劑量，今后可以選擇不同的藥物劑量對荷瘤裸鼠進行干預，來確定藥物最佳劑量，進一步為臨床診療提供理論依據。

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（收稿日期：2014-02-31） （本文編輯：歐麗）

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（收稿日期：2014-02-31） （本文編輯：歐麗）