即時高壓氧治療對大鼠腦缺血后腦水腫及水通道蛋白4表達的影響

陳方圓，于敏，張立新，張志強

·基礎研究·

即時高壓氧治療對大鼠腦缺血后腦水腫及水通道蛋白4表達的影響

陳方圓，于敏，張立新，張志強

目的觀察即時高壓氧治療對缺血早期腦水腫形成的影響，并探討其可能的機制。方法健康成年雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠18只，隨機分為假手術組(n=6)、對照組(n=6)和高壓氧組(n=6)。對照組及高壓氧組采用線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型，其中高壓氧組在艙內升壓時進行模型制備并予高壓氧治療60 min。各組均于術后6 h行Longa評分法評分，采用干濕比重法檢測腦組織含水量，免疫組化SP法觀察水通道蛋白4(AQP4)表達，應用圖像分析系統進行半定量分析。結果與對照組比較，高壓氧組大鼠神經功能評分改善(P＜0.05)，缺血半球腦含水量減少(P＜0.05)，AQP4表達量減少(P＜0.05)。結論即時高壓氧治療可有效緩解腦缺血后癥狀，對腦水腫的發生有抑制作用；AQP4表達減少可能是其機制之一。

腦缺血；高壓氧；神經功能評分；腦水腫；水通道蛋白4；大鼠

[本文著錄格式]陳方圓，于敏，張立新，等.即時高壓氧治療對大鼠腦缺血后腦水腫及水通道蛋白4表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2014,20(9):823-826.

腦是人體最重要的器官，質量僅占體質量的2%～3%，但其需氧量卻占全身供給量的20%～25%。腦中幾乎無葡萄糖和氧的儲備，因此腦組織對缺血缺氧耐受性極差。高壓氧目前被認為可能通過提高組織溶解氧含量及增加氧氣在組織中的彌散距離，改善組織缺氧狀態，從而避免組織因缺血缺氧發生的一系列損傷[1-2]。但同時高壓氧的干預時間及次數一直是學術界爭論的問題[2-3]。本實驗采用升壓過程中，在氧艙內制備大鼠腦缺血模型，缺血同時給予高壓氧治療，并以缺血后6 h神經功能學評分、腦組織含水量、水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)表達作為觀測指標，觀察即時高壓氧治療對局灶性腦缺血損傷的作用，并初步探討其治療機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與儀器

健康成年雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠18只，體質量200～250 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。標準飼料喂養，使用動物專用潔凈墊料，恒溫20～25℃。高壓氧治療采用煙臺宏遠GY3200型氧艙。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組將18只大鼠按隨機數表法隨機分為假手術組、對照組和高壓氧組，每組6只。假手術組不做造模處理，只相應解剖、分離和縫合；對照組建立局灶性大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型；高壓氧組則在高壓氧艙升壓過程中制備MCAO模型，升壓20 min，穩壓(2個大氣壓)70 min，穩壓后吸100%純氧60 min，中間休息兩個5 min；降壓20 min出艙。將大鼠置于約1 m3的密閉容器中，將氧氣管連接其中，并將該容器內溫度控制在22～25℃，其中放入少量碳酸鈣以吸收大鼠呼出的二氧化碳。

1.2.2 模型制備采用改良Longa線栓法。選用直徑0.26 mm市售尼龍魚線，剪成5 cm長，一端用細砂紙打磨光滑，頭端浸入液態硅膠中5 mm，確保提起后有薄層硅膠膜附于魚線表面，測量總直徑為0.27～0.30 mm，待硅膠涼干后使用。大鼠造模前禁食24 h，禁水6 h。稱重后3.5%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉。麻醉后動物仰臥固定于手術臺上，于頸前正中切開皮膚，游離右側頸總動脈(CCA)及其頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)，電凝ECA分支并結扎ECA。動脈夾夾閉CCA和ICA，在距CCA分叉3 mm處用4.5號針頭扎一小孔，將已栓線插入CCA，向上穿過CCA分叉處進入ICA；松開ICA的動脈夾，繼續將尼龍線插入到ICA顱內段，插入深度平均為(18.5± 0.5)mm，外留10 mm。結扎ICA起始段，固定栓線。消毒并逐層縫合皮膚。將動物側臥置于單獨的籠內。假手術組大鼠操作方法相同，只是插入魚線深度＜10 mm。

1.2.3 模型入選標準以上實驗動物均于6 h后斷頭取腦。取腦前參照Longa評分標準對實驗動物進行評分，評分0分或4分者剔除，死亡者剔除，其余視為造模成功，納入模型組。如模型組數量不足，則隨時補充每組所需數量。

1.2.4 觀測指標

1.2.4.1 一般行為學觀察術后按時觀察大鼠的外觀、反應、進食、活動等情況并進行記錄。

1.2.4.2 神經功能學評分模型成功后6 h，采用Longa評分法進行神經功能評分。0分，無明顯神經功能缺損(肢體活動正常)；1分，輕度局灶性神經功能癥狀缺失(不能完全伸展左側前肢)；2分，中度局灶性功能缺失(行走時向左側旋轉)；3分，重度神經功能缺失(行走時向左側傾倒)；4分，極重度損傷(不能自發行走，意識喪失)。

1.2.4.3 腦組織含水量測定各組缺血后6 h，麻醉后快速斷頭取腦。采用干濕比重法測定腦組織含水量。稱取濕重后，于85℃烤箱中烘烤至恒重，稱取干重，按Elliott公式計算腦含水量：

1.2.4.4 AQP4的表達神經功能評分完畢后，各組大鼠斷頭處死，取出完整腦組織，冠狀切下嗅球及額極前部約4 mm，取此切面向后約2 mm厚腦組織常規固定[4]，石蠟包埋，切片，片厚5 μm。相鄰切片置于經多聚賴氨酸包被的清潔載玻片上，SP法免疫組織化學染色。

切片脫蠟后置于3%H2O2溶液中孵育30 min，0.01 mol/L PBS(pH=7.4)滌洗5 min，共3次；置0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)中，加熱至100℃抗原修復3 min，室溫冷卻30 min；PBS洗5 min，共3次；正常山羊血清封閉液37℃孵育30 min，滴加一抗(兔抗大鼠AQP4多克隆抗體，l∶900稀釋)，4℃孵育過夜。PBS洗5 min，共3次；加入生物素化二抗工作液(山羊抗兔IgG)37℃孵育20 min；PBS洗5 min，共3次；加辣根過氧化物酶37℃孵育20 min；DAB顯色30 s；蘇木素復染后中性樹膠封片。每只鼠取1張完整切片，在腦皮質表達區取4個完整而不重疊的視野，高倍鏡視野下(400×)拍攝數碼照片后輸入計算機，采用醫學圖像分析系統BI-2000測定每個視野下AQP4蛋白平均光密度值，取平均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 神經功能學評分

對照組和高壓氧組大鼠在造模6 h后均出現不同程度神經功能缺損體征：行動遲緩、拖步，被提尾懸空時左側前肢不能伸直，行走時向左側傾倒、轉圈等。高壓氧組神經功能學評分低于對照組。見表1。

表1 各組大鼠神經功能學評分

2.2 腦組織含水量

各組缺血對側腦組織含水量無顯著性差異(P＞0.05)。缺血側對照組和高壓氧組均高于假手術組(P＜0.05)，對照組高于高壓氧組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組腦組織含水量(mg%)

2.3 AQP4表達

圖1 對照組及高壓氧組AQP4表達

AQP4陽性表達多位于血管周邊的星形膠質細胞足突上，胞漿內亦有少量表達，胞核未見表達。陽性細胞為空泡狀，且在缺血灶周邊的表達輕于缺血核心區。對照組缺血側可見大量AQP4陽性細胞表達，高壓氧組表達低于對照組。見圖1、表3。

表3 各組腦組織AQP4表達(平均光密度值)

3 討論

目前研究認為，高壓氧的治療機理主要是在高壓狀態下，氧氣在組織中的溶解量及彌散距離得以增加，并以生理方式經體液循環供應到全身各處，特別是缺氧組織中，從而糾正缺氧，延緩因缺氧造成的組織傷害，促進組織修復[1-3]。本實驗采用缺血同時給予高壓氧治療，目的是最大限度發揮高壓氧對缺血組織的保護作用。實驗發現，缺血同時給予單次高壓氧治療即可有效改善腦梗死后肢體功能。大鼠腦缺血后6 h的神經功能缺損體征，包括行動遲緩、拖步，被提尾懸空時左側前肢不能伸直，行走時向左側傾倒、轉圈等，高壓氧組均較對照組有一定程度減輕，神經功能評分高壓氧組與對照組比較有顯著性差異；這與高壓氧組腦水腫程度減輕、AQP4表達量下降的結果一致。

AQPs是一種紅細胞膜上的膜通道蛋白，目前被認為有極高的水通透性，而對其他小分子不通透。迄今為止，在哺乳動物腦組織中共發現3種水通道蛋白：AQP1、AQP4和AQP9。AQP4為其中最重要的一種，主要分布在側腦室及導水管的室管膜細胞、脈絡叢上皮、下丘腦、視上核、海馬齒狀回和小腦的Pukinje細胞[5-8]。有研究證實，體外培養敲除AQP4基因的星形膠質細胞，對水分子的通透性降低[9-10]，提示AQP4在腦組織液體轉運，腦水腫的發生、發展及消散，腦脊液的生成及重吸收等方面發揮著重要作用。

本研究顯示，AQP4在腦缺血中心及周邊神經細胞中均有高表達，可能與缺血后應激反應所致腦血管收縮，使缺血中心和周邊腦組織中存在不同程度缺血、缺氧有關。實驗中還發現，腦缺血后AQP4的表達和腦水腫的變化一致，AQP4表達量高則腦水腫程度重，AQP4表達量低則腦水腫程度輕，相關研究證實了這一結論[8,11-12]。

如果能有效抑制AQP4的表達，將有可能減輕缺血后腦水腫的程度。Papadopoulos等的實驗證實，AQP4基因敲除小鼠，損傷后腦水腫的形成明顯滯后于未敲除組，而60 h的生存率亦明顯提高[9-10]。本研究顯示，腦缺血經過高壓氧干預，腦組織水腫程度降低。說明在缺血早期，單次高壓氧治療即能有效減輕缺血后組織的水腫程度。有研究指出，早期和每日多次高壓氧治療能更為有效地降低缺血后腦組織的水腫程度，提高存活率。

眾多研究表明，高壓氧減輕腦水腫存在多種途徑和機制，抑制AQP4表達僅是其中一種。有人認為，高壓氧可通過抑制低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表達，減輕腦組織的水腫程度[13-15]等。詳細機制還需進一步研究證實。

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Effects of Instant Hyperbaric Oxygen Therapy on Brain Edema and Expression of Aquaporin-4 after Cerebral Ischemia in Rats

CHEN Fang-yuan,YU Min,ZHANG Li-xin,ZHANG Zhi-qiang.Rehabilitation Center,Shengjing Hospital,China Medical University, Shenyang,Liaoning 110022,China

ObjectiveTo observe the effects of instant hyperbaric oxygen(HBO)therapy on brain edema and aquaporin-4(AQP4)expression after cerebral ischemia in rats.Methods18 healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=6), control group(n=6)and HBO group(n=6).Middle cerebral artery occlusion model was established with modified Longa method in the control group and HBO group.HBO was administered after cerebral ischemia immediately in HBO group for 60 min.They were observed with the neurological function score,brain tissue water content and AQP4 experssion 6 h after operation.ResultsCompared with the control group,the neurological score in HBO group improved significantly(P＜0.05),while the brain tissue water content and brain AQP4 expression decreased(P＜0.05).ConclusionHBO may improve the neurological function and brain edema after cerebral ischemia,which may relate with inhibiting the expression ofAQP4.

cerebral ischemia;hyperbaric oxygen;neurological score;brain edema;aquaporin-4;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.09.008

R743.3

A

1006-9771(2014)09-0823-04

2013-10-23

2013-11-27)

國家自然科學基金資助項目(No.81101462)。

中國醫科大學附屬盛京醫院康復科，遼寧沈陽市110022。作者簡介：陳方圓(1987-)，女，漢族，遼寧沈陽市人，碩士，醫師，主要研究方向：高壓氧治療腦血管病。通訊作者：張志強，男，漢族，遼寧沈陽市人，主任醫師，博士生導師，主要研究方向：物理因子治療腦血管病。E-mail:zhangzq@sj-hospital.org。