N-叔丁基-α-苯基硝酮對大鼠脊髓損傷后神經生長因子表達的影響

劉少輝，劉偉，邱少汕，徐錫金

N-叔丁基-α-苯基硝酮對大鼠脊髓損傷后神經生長因子表達的影響

劉少輝，劉偉，邱少汕，徐錫金

目的觀察N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)對脊髓損傷大鼠脊髓組織和血清中神經生長因子(NGF)蛋白表達的影響。方法174只健康雌性Sprague-Dawley大鼠，體質量180～220 g，隨機分為正常對照組(n=54)、生理鹽水(NS)對照組(n=60)和PBN組(n=60)，每時間段6只。鞘內置管后，采用自行改制的ò型NYU裝置建立大鼠脊髓損傷模型。PBN組鞘內注射PBN 3 mg(15μl)，NS對照組注射NS 15μl，術后30min第1次注射，連續注射7 d，每天1次。術前3 d和1 d，以及術后1 d、5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d和35 d對NS對照組和PBN組進行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運動功能評價，并在術后1 h、12 h、24 h、48 h、3 d、7 d、14 d和21 d各組取血清和脊髓組織測定NGF水平。結果術后血清中NGF蛋白含量出現明顯改變，而脊髓組織中含量變化不明顯。血清NGF/總蛋白比值48 h時達到峰值，NS對照組(0.92%±0.02%)與PBN組(0.77%±0.05%)相比有顯著性差異(P= 0.021)。兩組大鼠BBB評分在傷后第10天開始升高，PBN組恢復程度明顯好于NS對照組(P＜0.01)。結論PBN能有效降低脊髓損傷大鼠血清中NGF蛋白的表達，促進神經功能恢復。

脊髓損傷；自由基；N-叔丁基-α-苯基硝酮；神經生長因子；大鼠

[本文著錄格式]劉少輝，劉偉，邱少汕，等.N-叔丁基-α-苯基硝酮對大鼠脊髓損傷后神經生長因子表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2014,20(8):709-712.

脊髓損傷(spinal cord injury)導致軀體運動與感覺神經功能等一系列的損害。其中慢性中樞性神經疼痛(chronic central neuropathic pain,CNP)嚴重影響患者的生活質量，甚至是自殺的原因之一[1]。脊髓損傷后繼發產生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)與中樞性痛覺敏化密切相關。活性氧及其誘導產生的致炎因子與神經營養因子如神經生長因子(nerve growth factor,NGF)和腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)結合，使谷氨酸受體蛋白的磷酸化上調，谷氨酸釋放增多，誘發疼痛信號轉導系統的激活，導致脊髓損傷后中樞性疼痛敏化的發生[2-3]。

本研究在應用自由基清除劑N-叔丁基-α-苯基硝酮(α-phenyl-N-tert-butylinitrone,PBN)抑制大鼠脊髓損傷后中樞性痛覺敏化表現的基礎上，進一步觀察脊髓損傷大鼠脊髓組織和血清中NGF的變化，探討脊髓損傷后活性氧下游谷氨酸受體激活和相關細胞因子所致中樞性痛覺敏化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取174只健康成年SPF級雌性Sprague-Dawley大鼠，體質量180～220 g，由南方醫科大學動物實驗中心提供(合格證號：SCXK粵2006-0015)。將大鼠在實驗環境中適應性飼養3 d，隨機分為正常對照組(n= 54)和脊髓挫傷組(n=120)[4]。脊髓挫傷組又分為生理鹽水(normal saline,NS)對照組(n=60)和PBN組(n=60)。各組手術前后因麻醉死亡的，從每批次組中補充。

本實驗經汕頭大學醫學院實驗動物倫理審查委員會批準。實驗結束后，采用麻醉處死動物。

1.2 脊髓損傷模型制備

用0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔內注射麻醉，腰背部脫毛，常規消毒，暴露脊髓棘突。固定T8-12棘突，咬開T9-11棘突及T9-10椎板，充分顯露硬脊膜約1 cm，避免損傷硬脊膜[5-7]。于所暴露脊髓尾端旁側，在顯微手術鏡下，縫線針刺穿硬脊膜孔，見少量腦脊液流出時，將充滿相應液體的PE-10微管向頸部方向插入約6 mm。縫扎固定于豎脊肌，穿過皮下，到達頸部，暴露出15 cm，以熱熔蠟封閉。根據Basso等[8]介紹的脊髓沖擊損傷模型，采用自行改制的ò型NYU裝置[2]，根據NYU實驗標準，對暴露脊髓大鼠的T10進行撞擊(150 kDyne)，停留1 s。撞擊后，用傷口周圍脂肪組織填充骨缺損部位，創口撒上青霉素粉，分層縫合。在撞擊造成損傷后15min，鞘內注射PBN 3 mg(15μl)。PBN注射濃度是通過組內對比，找出能最大限度減輕機械性和溫度性異常性疼痛的劑量。NS對照組注射NS 15μl。注射后用10μl NS沖洗微管。連續注射7d，每天1次，共8次[9]。

大鼠術后3h內開始飲食。手術后立即使用青霉素1×106U注射，7 h后第2次注射，此后，每天1次，連續3 d以上。人工膀胱按摩排尿每天2次。所有的脊髓挫傷大鼠在4d后達到自主排尿。

1.3 取材

于術前及術后1h、12h、24h、48h、3d、7d、14d和21d每組各取6只。用0.3%戊巴比妥鈉30 mg/ kg腹腔內注射麻醉后，打開胸腔暴露心臟與大血管，左心室抽取血液1.5 ml，置Eppendorf管，室溫下2 h，4℃冰箱內靜置過夜，3000 r/min離心15min，吸取上清液，-80℃分裝保存。采血后，在左心室插灌注導管，止血鉗固定并封閉采血針孔，剪開右心耳，灌注肝素化生理鹽水200 ml(50 U/ml)沖洗，隨后灌注4℃4%多聚甲醛250 ml，取損傷節段脊髓組織[10]。

1.4 脊髓組織總蛋白提取

采用組織總蛋白提取試劑盒(ChemiKine, CN.2140)提取組織總蛋白。按照說明要求進行操作。吸取上清液，-80℃分裝保存。

1.5 蛋白含量檢測

血清和脊髓組織總蛋白的測定使用BCA Protein Assay Kit(Santa Cruz Biotechnology Inc.,sc-202389)， 562nm處測平均光密度值(OD)(RAYTO RT-2100C)。血清和脊髓組織中NGF蛋白含量測定使用大鼠NGF ELISA 96孔板試劑盒(ChemiKine,CYT304)，492nm測OD值(RAYTO RT-2100C)。按照各自說明書進行操作。

1.6 BBB運動功能評價(The Basso-Beattie-Bresnahan Locomotor Rating Scale)[8]

在手術前3～5 d(體質量200～245 g)，各組剩余6只大鼠均進行BBB運動功能評價，以確定行為基線。術后1d、5d、10d、15d、20d、25d、30d和35d時分別進行BBB運動功能評價。

測試時間固定在9:00～12:00，由對分組情況不知情的測試人員在25℃安靜的環境中，將大鼠放入60× 50×45 cm的透明有機玻璃箱中，適應20～30min，待其安靜后開始檢測。

1.7 統計學分析

采用SigmaStat 3.5和SigmaPlot 10.0軟件分別進行統計和制圖。計量資料用(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用配對t檢驗。顯著性水平α＝0.05。

2 結果

2.1 大鼠血清中NGF蛋白含量變化

通過檢測大鼠血清NGF濃度和血清總蛋白濃度，計算各時段NGF蛋白所占總蛋白含量的比值(見圖1)。結果顯示，術后48 h血清NGF/總蛋白比值迅速上升，達最高水平，且NS對照組(0.92%±0.02%)與PBN組(0.77%±0.05%)相比有顯著性差異(P=0.021)。術后第3天，NS對照組血清NGF/總蛋白比值迅速回落，而PBN組一直處于相對低水平表達狀態，在術后7 d停止給予PBN治療后略顯增加。

圖1 三組大鼠血清NGF蛋白含量變化

2.2 大鼠脊髓組織中NGF蛋白含量變化

脊髓組織中NGF蛋白含量與血清NGF蛋白含量變化總趨勢沒有明顯差異。術后12 h開始，NS對照組各時段NGF蛋白水平出現波動較大，與PBN組各時段相比無顯著性差異(見圖2)。術后7 d，PBN組NGF蛋白表達呈現逐步升高趨勢，但各時段組內比較也無顯著性差異。NS對照組各時段相對PBN組NGF表達水平相對略高。

圖2 NS對照組和PBN組大鼠脊髓組織中NGF蛋白含量變化

2.3 大鼠運動功能恢復情況

兩組大鼠BBB評分在傷后第10天開始各時間點都有非常顯著性差異(見圖3)，PBN組恢復程度明顯好于NS對照組。其中第20天時間點，NS對照組BBB評分為(4.010±0.426)，PBN組為(8.883±0.423)；第35天時間點，NS對照組為(9.250±0.463)，PBN組為(16.750±0.524)。各時間點兩組評分值之間有非常顯著性差異(P＜0.01)。

圖3 NS對照組和PBN組BBB運動功能評分

3 討論

中樞性疼痛是脊髓損傷所致的多種慢性疼痛中的一種，包括在沒有可見的刺激條件下出現的自發痛與由刺激所誘發的傷害性刺激痛覺過敏以及非傷害性刺激的痛覺超敏誘發痛[11]。表現為多特征、部位廣泛的疼痛和/或感覺缺失，并隨脊髓損傷時間的延長而增加。

脊髓損傷后中樞性疼痛的產生與中樞神經系統興奮性過高密切相關[1]。可能與脊髓感覺下行抑制的解除，感覺傳入缺失使脊髓及丘腦感覺神經元高度興奮，以及突觸遞質釋放與受體活性的改變、脊髓的出芽增殖等所有可使背角神經元保持高興奮性的改變相關。由于脊髓組織膜結構含有豐富脂質，脊髓損傷后組織缺血、缺氧及水腫引起活性氧產生增加，且清除功能下降，致使自由基在局部堆積。作為氧代謝產物的活性氧包括超氧自由基、過氧化氫及其下游產物過氧化物和羥化物等，可以參與脂質過氧化、DNA鏈斷裂、蛋白質修飾變性及影響細胞內信號轉導和基因表達，既可引起神經細胞和組織能量代謝系統障礙，又可觸發胞內Ca2+內流，使Ca2+超載，且使Ca2+-ATP酶失活，還可直接導致神經變性壞死[12]。

脊髓組織損傷后導致氧自由基堆積的原因主要包括三個方面：第一是由于損傷組織缺氧，細胞能量合成減少，ATP分解增多，AMP濃度增高，黃嘌呤氧化酶被激活，作用于蓄積在細胞內的次黃嘌呤及其他一些底物，使氧分子獲得一個電子，而形成過氧化氫、羥自由基及其他離子[13]；第二是損傷時中樞神經元釋放大量兒茶酚胺類和5-羥色胺等神經遞質，這些遞質不僅影響微血管自動調節功能，而且在自身氧化過程中，將電子傳遞給氧分子，產生自由基[14]；第三是組織損傷激活磷脂酶A2，作用于花生四烯酸生成前列腺素，在前列腺素G2轉化為前列腺素H2的過程中，將電子傳遞給氧分子，產生超氧陰離子自由基。

由于自由基的特點是未配對的電子，這種未配對的電子容易脫離自由基電子軌道而成為自由電子。大量的自由電子形成損傷局部負電位，形成電位差。當電位差達到閾值電位時，Na+、K+通道開放，膜電位翻轉，產生動作電位，引起疼痛[15]。而PBN在組織中能很好地消除堆積的活性氧，從而消除或減低疼痛的產生。

近年來的研究表明，活性氧誘導中樞性痛覺性敏化的產生，可能通過三個方面實現。

第一方面是活性氧通過激活谷氨酸受體來實現。谷氨酸受體廣泛存在于中樞和外周神經系統，在脊髓背角神經元上有特異性分布，因其受體激活，可介導外周傷害性信息的傳遞。

第二方面是通過促進致炎細胞因子(白細胞介素-1α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-β)的產生[16]。如白細胞介素-1β可通過上調P物質及NGF的表達，敏化脊髓后角神經元，也可使脊髓神經元處于過度興奮狀態，易化突觸，并可通過抑制神經膠質細胞清除突觸間谷氨酸，使神經元處于高度興奮狀態[17]。

第三方面就是活性氧通過影響神經營養因子的釋放，特別是NGF和BDNF。NGF的增加，可以導致BDNF的上調，后者可調控脊髓背角神經元的功能，激發突觸效能的改變[18]。

脊髓損傷后損傷組織細胞內的谷氨酸立即增加，介導細胞內谷氨酸受體途徑立即被激活，包括細胞內Ca2+、環氧化酶-2(cyclooxygenase,COX-2)介導的前列腺素途徑活性增強，導致活性氧的形成。當二次損傷進一步加深時，由于氧化應激結果促進嗜中性粒細胞介導炎癥反應，產生大量致炎細胞因子[19]，使外周血液中的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞浸潤到脊髓實質，浸潤的淋巴細胞、巨噬細胞和嗜酸性粒細胞可以分泌NGF，從而導致初級傳入神經的敏化[20]。

通常脊髓損傷后1 h為脊髓谷氨酸波動末期，6 h時脊髓中一些促炎細胞因子達到高峰，24 h時中性白細胞產生達到高峰，48 h時血清中NGF水平達到高峰，第14天部分大鼠中開始出現異常性疼痛，第35天時所有大鼠出現異常性疼痛。

本研究結果與上述病理機制基本一致。48 h時血清中NGF蛋白含量迅速增加，達最高水平，且NS對照組與PBN組相比較有顯著性差異。術后第3天，NS對照組血清NGF/總蛋白比值迅速回落，而PBN組血清NGF蛋白一直處于相對低水平表達狀態，在術后7 d停止給予PBN治療后略顯增加。表明PBN能夠有效清除損傷組織產生的活性氧，并降低活性氧引起的二次損傷。同時也表明，脊髓損傷后血清NGF蛋白的增加與活性氧激活密切相關。為進一步闡明脊髓損傷后活性氧下游谷氨酸受體激活和相關細胞因子所致中樞性痛覺敏化的機制以及臨床動態觀察抗氧化劑的治療效價提供依據。

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Effect of α-phenyl-N-tert-butylinitrone on Expression of Nerve Growth Factor in Spinal Cord Injured Rats

LIU Shao-hui,LIU Wei, QIU Shao-shan,XU Xi-jin.Department of Cell Biology and Genetics,Shantou University Medical College,Shantou,Guangdong 515041, China

ObjectiveTo explore the effect of α-phenyl-N-tert-butylinitrone(PBN)on expression of nerve growth factor(NGF)in serum and spinal cord tissue in rats after spinal cord injury(SCI).Methods174 female Sprague-Dawley rats were randomly assigned to following groups:normal control group(n=54),normal saline control group(NS group,n=60,intrathecally injected normal saline 15μl),and PBN group(n=60,intrathecally injected PBN,3 mg,15μl).The model was established with New York University blow device(150 kDyne, 1 s dwell time).PBN was intrathecally injected into the damaged areas 30min after operation,then once a day for 7 days.The Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)Locomotor Rating Scale was used to assess the rats 3 days and 1 day before,and 1 day,5 days,10 days,15 days,20 days, 25 days,30 days and 35 days after SCI.NGF in the injured spinal cord tissue and serum was measured 1 h,12 h,24 h,48 h,3 days,7 days, 14 days and 21 days after SCI.ResultsNGF increased in serum but not in spinal cord.The ratio of NGF/total protein in serum rose and peaked 48 h after SCI,and the ratio was higher in NS group(0.92%±0.02%)than in PBN group(0.77%±0.05%)(P=0.021).BBB scores increased from the 9th day,and PBN group improved better than NS group(P＜0.01).ConclusionPBN could reduce the expression of NGF in the SCI rats,and promote the recovery of neurol function.

spinal cord injury;free radical;α-phenyl-N-tert-butylinitrone;nerve growth factor;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.08.002

R651.2

A

1006-9771(2014)08-0709-04

2013-07-17

2014-01-21)

1.廣東省自然科學基金項目(No.10151503102000008)；2.汕頭大學醫學院李嘉誠科研基金資助項目(No.200906)。

汕頭大學醫學院細胞生物學與遺傳學教研室，廣東汕頭市515041。作者簡介：劉少輝(1964-)，漢族，男，廣東河源市人，助理實驗師，主要從事脊髓損傷修復基礎研究。通訊作者：徐錫金，男，醫學博士，教授。E-mail:xuxj@stu.edu.cn。

時間：2014-06-13 10:05

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3759.R.20140613.1005.002.html