Cx43蛋白在豐富環境改善腦外傷大鼠學習記憶能力中的作用

江山，李婭娜，謝紅萍，王會會，李玲

Cx43蛋白在豐富環境改善腦外傷大鼠學習記憶能力中的作用

江山，李婭娜，謝紅萍，王會會，李玲

目的觀察Cx43蛋白在豐富環境改善腦外傷(TBI)大鼠學習記憶能力中的作用。方法選用成年Sprague-Dawley大鼠，采用液壓顱腦損傷儀制作TBI模型，將模型大鼠分為豐富環境刺激組(A組)、常規飼養組(B組)、Cx43特異性反義寡聚核苷酸(Cx43-ASODN)+豐富環境刺激組(C組)和亂序ODN(scrambled sequence ODN)+豐富環境刺激組(D組)，每組6只。另設6只正常大鼠作為對照組。C組和D組分別在海馬區注射Cx43-ASODN(2 μl/d/rat,1.5 mmol/L)和ScrbASODN(2 μl/d/rat,1.5 mmol/L)。飼養14 d，采用水迷宮測試評估大鼠的學習記憶能力。結果B組大鼠潛伏期大于對照組(P＜0.05)，穿越次數少于對照組(P＜0.05)。A組潛伏期小于B組(P＜0.05)，且從第9天起與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)；穿越平臺次數多于B組，與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。C組大鼠的潛伏期大于A組(P＜0.05)，穿越平臺次數少于A組(P＜0.05)。結論Cx43蛋白參與豐富環境改善TBI大鼠學習記憶能力的調控。

腦外傷；Cx43蛋白；學習記憶能力；豐富環境；大鼠

[本文著錄格式]江山，李婭娜，謝紅萍，等.Cx43蛋白在豐富環境改善腦外傷大鼠學習記憶能力中的作用[J].中國康復理論與實踐,2014,20(10):924-927.

腦外傷(traumatic brain injury,TBI)可以致使患者出現嚴重的學習記憶能力障礙。近年來，本課題組發現，給予TBI大鼠豐富環境(enriched environment, EE)，可以顯著提高大鼠的學習記憶能力[1]，改善其認知功能，但是其具體機制尚不明了。

在中樞神經系統，Cx43蛋白主要表達于海馬區的星形膠質細胞(astrocyte)[2-4]。隨著RNA干擾(RNA interference,RNAi)、基因嵌入或敲除(knock in or out)等技術的發展，越來越多的研究證據表明，Cx43半通道在腦缺血、缺氧損傷的病理生理過程中發揮了重要作用，主要表現為參與各種信號的傳遞[5]。此外，近來的研究發現，Cx43半通道參與腦高級神經功能的信息傳導，包括學習記憶能力[6-7]。

本研究采用液壓沖擊法制作大鼠TBI模型，給予豐富環境刺激，采用神經藥理學技術及水迷宮技術，觀察Cx43蛋白在豐富環境改善TBI大鼠學習記憶能力中的作用，以期探討豐富環境改善TBI大鼠學習記憶能力的調節機制，為加強臨床TBI患者的治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗分組

二級雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體質量(210±10)g，年齡8～10周，由解放軍總醫院實驗動物中心提供。將TBI模型大鼠隨機分為豐富環境刺激組(A組)、常規飼養組(B組)、Cx43特異性反義寡聚核苷酸(Cx43-ASODN)+豐富環境刺激組(C組)、亂序ODN (scrambled sequence ODN)+豐富環境刺激組(D組)，每組6只。D組作為陰性對照組，目的是為了排除Cx43-ASODN的非特異性反應。另6只正常大鼠為對照組。

1.2 TBI模型大鼠制作

按文獻所述的方法制作大鼠TBI模型[1]：采用美國VCU液壓顱腦損傷儀。大鼠用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀上，沿頭顱正中切開頭皮暴露顱骨，于前囟后4.8 mm、中線向右旁開4 mm處用牙科鉆輕輕鉆一個直徑為4.8 mm的骨窗，連接液壓顱腦損傷儀的打擊管，同時通過打擊錘對活塞的打擊，將管道內液體傳導至顱腔，致傷壓力≤1.7 atm(1 atm=101.325 kPa)，損傷后縫合大鼠頭皮并正常喂養3 d進行下一步實驗(豐富環境刺激或常規飼養)。

1.3 方法

豐富環境籠[1]是一個大小為820×610×450 mm的金屬網籠，內部距地面150 mm處固定兩塊水平板，寬70 mm，一塊靠籠壁固定，另一塊依角固定。另有一塊升降板可上下調節高度。籠中還有一條繩鏈、一個秋千、一些物品(不同形狀、材料的積木)、一個塑料管隧道、一些不同顏色的玻璃球、一個高低杠、一個推棒。每周清潔并用新形狀、顏色、材料的物品替換舊的物品，重擺物品的位置，改變升降板距底面的高度。豐富環境刺激的時間為14 d，每天刺激時長為2 h。A組、C組和D組均進行豐富環境刺激。

在C組和D組中，參照既往文獻，每天在大鼠雙側海馬區注射點(AP-3.5 mm，ML±2.0 mm,DV2.7 mm)用微量進樣器(上海高欣玻璃儀器廠)注射1.5 mmol/L Cx43-ASODN(Sangon Biotech合成)2 μl或1.5 mmol/L ScrbASODN(Sangon Biotech合成)2 μl，隨后進行豐富環境刺激。Cx43-ASODN的序列為5'ACTCCAGTCACCCAT 3'(NCBI Genbank)，它可以特異性地阻斷Cx43蛋白的表達[8-10]。

1.4 評價方法

本研究采用Morris水迷宮(Morris water maze)檢測大鼠的學習記憶能力[11]。Morris水迷宮為一盛水的黑色圓形水池，水深約為37 cm，直徑約為178 cm。水溫21～24℃。水池被等分為A、B、C、D共4個象限。在C象限，距池壁約28 cm處放置一直徑約10.2 cm的透明有機玻璃平臺，固定后使平臺沒于水面下2 cm處。

大鼠造模3 d后進行水迷宮測試[11]。①定位航行試驗：每天上午把各組大鼠從4個象限隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠尋找且爬上站臺所需時間，該時間稱之為潛伏期(latency to platform)。如果大鼠2 min內找不到站臺，則將其引至站臺上30 s后放回籠中，此時潛伏期記為90 s。該試驗持續13 d，其中第6天和第7天，大鼠休息不進行試驗。因此該試驗的第一部分(1～5 d)是為了測定大鼠的記憶獲取能力(memory acquisition testing)，而第二部分(8～13 d)是為了測定大鼠的記憶保持能力(memory retention testing)。②空間探索試驗：在第14 d，撤走平臺，從4個象限將大鼠面朝池壁放入水中，記錄其在120 s內穿越平臺所在區域的次數(platform crossings)。以上數據均采用Ethovision software系統進行檢測記錄。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 豐富環境對TBI學習記憶能力的影響

在水迷宮測試的第1～5天，B組大鼠的潛伏期大于對照組(P＜0.05)，第8～13天，B組的潛伏期仍然大于對照組(P＜0.05)；對照組穿越平臺(9±1)次，而B組穿越(4±1)次(P＜0.05)。見圖1、圖3。

從第4天起，A組大鼠潛伏期小于B組(P＜0.05)，從第9天起，與對照組之間無顯著性差異(P＞0.05)；A組的穿越次數多于B組(P＜0.05)，與對照組之間無顯著性差異(P＞0.05)。見圖1、圖3。

2.2 Cx43-ASODN對豐富環境所誘導的TBI大鼠學習記憶能力的影響

第3～5天，C組大鼠的潛伏期分別為(66±11)s、(43±4)s、(46±7)s，大于A組(P＜0.05)，第8～13天，C組大鼠的潛伏期同樣大于A組(P＜0.05)。C組大鼠的穿越次數少于A組(P＜0.05)。見圖2、圖3。

D組大鼠潛伏期和穿越平臺次數與A組比較均無顯著性差異(P＞0.05)。見圖2、圖3。

圖1 對照組、A組、B組大鼠水迷宮潛伏期的變化情況

圖2 A組、C組、D組和對照組大鼠水迷宮潛伏期的變化情況

圖3 各組大鼠水迷宮平臺穿越次數情況

3 討論

本研究采用Cx43-ASODN來探討Cx43蛋白在豐富環境誘導TBI大鼠學習記憶能力改善中的作用。

近年來，隨著地震、海嘯、交通事故、樓房坍塌等頻繁發生，TBI的發病率呈現上升趨勢[12]。目前在臨床上，大部分中重度TBI患者都存在認知障礙，其中最為常見的是學習記憶能力的障礙，這大大降低了TBI患者康復訓練的效果，對TBI的康復預后產生不良影響。因此如何提高TBI患者的學習記憶能力一直是目前研究的重點。

1947年，美國人Hebb首先提出豐富環境的概念[13]。豐富環境能夠提供給試驗動物多感官刺激和運動的機會，并且賦予相互間社交性行為的可能。經過數年的研究發現，豐富環境能夠增加腦損傷動物中樞神經系統的可塑性，例如神經元樹突變長、密度增大、軸突及突觸增多等。

而本研究的結果更是表明，在定位航行試驗的第1～5天，B組大鼠的潛伏期長于對照組(P＜0.05)，這說明，TBI后大鼠的記憶獲取能力(即學習能力)降低；測試的第8～13天，B組的潛伏期長于對照組(P＜0.05)，這說明，TBI后大鼠的記憶保持能力也下降。此外，在空間探索試驗中，B組的穿越次數少于對照組(P＜0.05)。以上結果說明TBI降低大鼠的學習記憶能力。而給予TBI大鼠豐富環境刺激后，在定位航行試驗中，從第4天起，A組大鼠的潛伏期小于B組(P＜0.05)；而從試驗第9天起，A組與正常對照組之間已無顯著性差異(P＞0.05)。而在空間探索試驗中，A組的穿越次數多于B組(P＜0.05)，與正常對照組之間無顯著性差異(P＞0.05)。以上結果說明，豐富環境刺激能改善TBI大鼠的學習記憶能力。這提示我們，在臨床上，對于TBI患者，除了給予其基本的藥物治療，還要給予其各種豐富環境刺激，以達到改善其學習記憶能力障礙的目的，這樣才能使患者真正地重返家庭、工作和社會。

Cx43蛋白是構成細胞間縫隙連接(gap junction, GJ)的基本結構和功能的一大類膜蛋白。它主要表達于中樞神經系統的星形膠質細胞與心肌細胞[2-4]。它可以允許分子量小于1200 Da的小分子直接通過，提供迅速而直接的細胞間通訊[14]。一個縫隙連接由兩個半通道(hemichannel)構成，而每個半通道由3個Cx43蛋白構成。既往的研究表明，Cx43蛋白一方面可以迅速地傳遞損傷或死亡信息至周圍的細胞，導致周邊區細胞出現凋亡或死亡(gap junction-mediated bystander effect)[15]；而另一方面，它又可以將一些有益的神經營養因子、遞質或第二信使傳遞至周邊細胞，產生一系列神經保護作用(good samaritan effect)[16]。

也有研究表明，應用Cx43特異性ASODN可以暫時敲除Cx43蛋白的表達[8-10]。因此，本研究采用Cx43-ASODN來探討Cx43蛋白在豐富環境誘導TBI大鼠學習記憶能力改善中的作用。我們發現，C組大鼠與A組相比，學習記憶能力下降，如在定位航行試驗中，第3～5天，大鼠的潛伏期長于A組(P＜0.05)；而經過2 d休息，在試驗第8～13天，大鼠的潛伏期仍然高于A組(P＜0.05)。這說明，阻斷了Cx43蛋白的表達，可以阻斷豐富環境刺激所致的TBI大鼠學習記憶能力的提高。在空間探索試驗中，C組大鼠的穿越次數少于A組，這同樣說明Cx43蛋白的作用。此外，為了排除ASODN的非特異性反應，我們還選用了亂序ODN作為陰性對照，結果表明，亂序ODN對于大鼠的學習記憶能力無影響，與A組大鼠之間無顯著性差異。這說明Cx43-ASODN所致的TBI大鼠學習記憶能力的降低與Cx43-ASODN試劑本身無關。這提示我們，豐富環境可能通過海馬區Cx43蛋白來發揮其對大鼠學習記憶能力調控的作用。

此外，國外的研究還發現，Cx43蛋白還能夠參與對大鼠杏仁外側核團(basolateral amygdala)恐懼記憶的調控，其調控作用是通過膠質遞質(gliotransmitter)來完成的[6]。這提示我們，在豐富環境對TBI大鼠學習記憶能力調控的過程中，膠質遞質是否也發揮了同樣的作用？這也是我們下一步研究的重點。

Cx43蛋白是磷酸化蛋白，其磷酸化與非磷酸化狀態的轉化將調節縫隙連接或者Cx43半通道的開放與關閉，進而影響其功能。研究表明，蛋白激酶C (PKC)與絲裂原活化的蛋白激酶(MAP)是調節通道開閉的兩種關鍵酶[17]。Cx43蛋白磷酸化將降低半通道的開放幾率，反之則將誘導通道的開放[18]。因此，豐富環境是否通過影響Cx43蛋白的磷酸化狀態，而發揮其功能，這還需要我們進行進一步的研究。

總之，本研究通過神經藥理學、神經行為學技術等發現，豐富環境可以改善TBI大鼠的學習記憶能力，Cx43蛋白可能參與了該調控過程。這一研究結果將為加強臨床TBI患者的神經修復、改善其受損功能的恢復提供依據，具有重要的理論和臨床應用價值。

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Effect of Cx43 Protein on Improvement of Learning and Memory Ability Induced by Enriched Environment in Rats with Traumatic Brain Injury

JIANG Shan,LI Ya-na,XIE Hong-ping,WANG Hui-hui,LI Ling.Department of Rehabilitation and Physiotherapy,the First Affiliated Hospital,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100048,China

ObjectiveTo explore the effect of Cx43 protein on improvement of learning and memory ability induced by enriched environment(EE)in rats with traumatic brain injury(TBI).Methods TBI model was made by fluid percussion injury(FPI)in Sprague-Dawley rats.The TBI rats were divided into EE group(A),standard housing(ST)group(B),Cx43 specific antisense oligonucleotides(Cx43 ASODN)+EE group(C)and scrambled sequence ODN+EE group(D)with 6 rats in each group.Another 6 normal rats were taken as the control group.Groups C and D were given hippocampal microinjection of Cx43-ASODN(2 μl/d/rat,1.5 mmol/L)and ScrbASODN(2 μl/d/ rat,1.5 mmol/L)respectively.Morris water maze was used to evaluated the learning and memory ability.ResultsThe latency was longer and the traversing times was less in group B than in the control group(P＜0.05).The latency was shorter in group A than in group B(P＜0.05),and there was no significant difference between group A and the control group(P＞0.05)from the 9th day after injury.The traversing times was more in group A than in group B and there was no significant difference between group A and the control group(P＞0.05).The latency was longer and the traversing times was less in group C than in group A(P＜0.05).ConclusionCx43 protein may participate in the improvement of the learning and memory ability induced by EE in rats with TBI.

traumatic brain injury;Cx43 protein;learning and memory ability;enriched environment;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.10.007

R651.1

A

1006-9771(2014)10-0924-04

2014-03-07

2014-04-23)

國家自然科學基金項目(No.81071595;No.81201514)。

解放軍總醫院第一附屬醫院，北京市100048。作者簡介：江山(1979-)，男，漢族，安徽桐城市人，博士，主治醫師，主要研究方向：神經康復。通訊作者：李玲，女，漢族，主任醫師，教授。E-mail:liling0519@126.com。