發酵中草藥對免疫功能低下小鼠的保護作用研究

謝全喜，趙 攀，王文春，張 文，王曉芳，張建梅*

（1.山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000；2.山東省濟南育賢中學，濟南 250022）

環磷酰胺（CTX）是一種細胞毒化療藥物，同時也屬于烷化劑類免疫抑制劑，其作用主要是通過與DNA雙鏈交叉連接破壞DNA結構，從而阻斷其復制，破壞免疫活性細胞，抑制其免疫性能[1]。CTX是已知最強的烷化劑類免疫抑制劑，對體液免疫、細胞免疫和非特異性免疫有很強的免疫抑制作用[2-3]。在免疫調節藥物的研究中，CTX經常被用來制備非特異性免疫功能低下模型。現代醫學研究結果表明，很多中草藥含有多糖類、有機酸類、生物堿類和揮發油類等物質，這些物質能夠提高動物機體的免疫力。紫莖澤蘭脫毒草粉的有效成分綠原酸具有廣泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤及增強免疫力的作用。板藍根具有抗菌、抗病毒及提高免疫力等作用，有研究發現，板藍根多糖能增強抗體形成細胞功能，增強小鼠靜脈注射碳粒廓清速率。紫錐菊提取物可以作為免疫調節劑，增強機體免疫力。發酵中草藥是將天然中草藥提取液用益生菌對其進行發酵，經過微生物轉化成為能夠被機體腸道直接吸收的小分子成分，使中草藥成為快速吸收、定量療效的新型藥物。本試驗將3種中草藥聯合，用芽孢菌7348對其進行發酵，研究其對CTX免疫抵制小鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

清潔級純系昆明小白鼠，體重20±2 g，雌雄各半，由山東魯抗動物實驗中心提供。

1.2 試驗材料

CTX由山西泰盛制藥有限公司提供；中草藥紫莖澤蘭脫毒草粉購自昆明科寶飼料科技有限公司；紫錐菊末購自齊魯動物保健品有限公司；板藍根購自泰安市永春堂永興藥店；芽孢菌7348為山東寶來利來生物菌種保藏中心保存。

準確稱取紫莖澤蘭脫毒草粉5 g、板藍根2 g和紫錐菊3 g，溶于100 mL蒸餾水中，盛放于500 mL三角瓶中，121℃滅菌30 min。按活菌數106cfu·mL-1接種芽孢菌7348，振蕩培養48 h，鏡檢芽孢脫落＞95%。將發酵液在45℃烘箱中烘干，用研缽研磨備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 免疫低下模型的建立及給藥

將100只昆明小鼠預飼3 d后隨機分為5組，每組20只，雌雄各兩個重復，每個重復5只，各重復小白鼠分籠飼喂基礎飼糧。分別為正常組、模型組及發酵中草藥低、中、高劑量組，中草藥組用發酵中草藥水溶液灌胃，劑量分別為100、200和400 mg·kg-1（灌胃劑量按小白鼠的采食量計算），1次·d-1，連續20 d。正常組和模型組灌胃蒸餾水。在灌胃的第5天開始，除正常組外，模型組和發酵中草藥組均腹腔注射CTX 40 mg·kg-1·d-1，連續5 d。

1.3.2 免疫器官指數

檢測末次給藥24 h后，稱量小鼠體重，斷頸處死，分離脾臟和胸腺，迅速剝離脂肪和其他結締組織后，濾紙吸凈臟器表面血污，稱重。計算脾臟指數和胸腺指數，免疫器官指數計算公式見式1。

1.3.3 血清生化指標

末次給藥24 h后，小鼠眼球取血，3 000 rpm離心10 min分離血清，用全自動生化分析儀測定谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）含量。

1.3.4 單核-巨噬細胞吞噬功能

末次給藥24 h后，稱量小鼠體重，按劑量0.1 mL·10 g-1給各小鼠尾靜脈注射印度墨汁20%；注射后2和20 min分別從小鼠的左眼眶和右眼眶取血20μL，加入0.1%NaCO3溶液10 mL，搖勻，于600 nm處測光密度值（OD值）；為校正因各小鼠脾臟、肝臟質量不同產生的差異，取血完畢后，斷頸處死小鼠，取肝臟、脾臟，用濾紙吸凈臟器表面血污，稱重。廓清指數和吞噬指數計算公式見式2～3。

式中，OD1、OD2分別為2和20 min時，取血測得的光密度值，t2、t1為注射印度墨汁后采血時間。

1.4 統計分析

試驗數據采用SPSS 13.0統計分析采用Oneway ANOVA進行方差分析，LSD法進行組間多重比較，結果均以“平均值±標準誤”表示。

2 試驗結果

2.1 對小鼠免疫器官指數的影響

各組小鼠脾臟的變化見附圖。

附圖 發酵中草藥對小鼠脾臟的影響

由附圖可見，2-模型組小鼠脾臟與1-正常組和中草藥組小鼠脾臟相比，體積顯著縮小，而3個發酵中草藥組脾臟體積變化不顯著。

發酵中草藥對小鼠免疫器官指數的影響見表1。

表1 發酵中草藥對小鼠免疫器官指數的影響mg·kg-1

由表1可知，與正常組相比，模型組和發酵中草藥高、中、低劑量組的脾臟指數和胸腺指數均極顯著降低（P＜0.01）；而與模型組相比，發酵中草藥高、中、低劑量組均能顯著提高免疫抑制小鼠的脾臟指數（P＜0.05），同時極顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數（P＜0.01），其中以中劑量發酵中草藥效果最佳，脾臟指數和胸腺指數分別比模型組高20.31%和71.64%。

2.2 對小鼠血清生化指標的影響

發酵中草藥對小鼠血清生化指標的影響見表2。

表2 發酵中草藥對小鼠血清生化指標的影響

由表2可知，與正常組相比，模型組ALT、AST和BUN含量均極顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，發酵中草藥給藥組ALT和AST含量顯著低于模型組（P＜0.05），且BUN含量極顯著低于模型組（P＜0.01）。在降低AST和BUN含量方面，發酵中草藥中劑量組添加效果最佳，分別降低11.52%和12.92%。

2.3 發酵中草藥對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

發酵中草藥對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響見表3。

表3 發酵中草藥對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

由表3可知，與正常組相比，模型組和發酵中草藥3個劑量給藥組廓清指數和吞噬指數均極顯著降低（P＜0.01），而3個給藥組的吞噬指數顯著將降低（P＜0.05）；發酵中草藥3個劑量給藥組的廓清指數和吞噬指數均顯著高于模型組（P＜0.05），其中以中劑量組效果最好，分別提高54.88%和27.85%。

3 討論

3.1 對小鼠免疫器官指數的影響

胸腺和脾臟分屬于中樞免疫器官和外周免疫器官，胸腺是T淋巴細胞成熟的場所，脾臟是成熟淋巴細胞和B細胞定植的場所，胸腺指數和脾臟指數可直觀的反映機體免疫功能的強弱[4-5]。受抗原刺激后，參與免疫的T細胞、B細胞和巨噬細胞大量增生，促進免疫器官發育；但受到免疫抑制影響時，淋巴組織萎縮，導致免疫器官體積縮小，免疫器官指數降低[6]。本試驗中小鼠灌服發酵中草藥后，3個給藥劑量組均可使CTX造成的胸腺萎縮小鼠的胸腺指數極顯著提高（P＜0.01），同時顯著提高脾臟指數（P＜0.05），雖然未恢復到正常水平，但顯示出其對CTX造成的免疫低下小鼠脾臟和胸腺的保護作用，其中以中劑量組添加效果最佳。

3.2 對小鼠血清生化指標的影響

ALT和AST活性是反映肝臟和心臟功能的重要指標。在正常情況下，這些酶主要存在于肝細胞中，血液中含量很少，只有在肝臟受損時才會大量釋放進入血液，所以血清中ALT和AST被認為是肝細胞受損傷最敏感的指標。BUN是體內氨基酸分解代謝的終產物之一，是反映機體營養狀況及蛋白質代謝的重要指標。一般認為血清BUN水平反映飼料蛋白利用的情況。血清BUN水平升高表示蛋白質分解加強，降低表示蛋白質合成增加。本試驗結果表明，中劑量給藥組ALT和AST含量顯著高于正常組（P＜0.05），且BUN含量極顯著高于正常組（P＜0.01），但ALT、AST和BUN含量均顯著低于模型組（P＜0.05）。說明添加發酵中草藥200 mg·kg-1對CTX造成的小鼠肝臟受損有一定程度的恢復作用。

3.3 對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

單核巨噬細胞系統是機體最重要的防御系統，其吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的標志之一，可以借助測定血流中碳粒的消失速度來反映單核巨噬細胞吞噬異物的能力。小鼠碳粒廓清實驗是檢驗機體非特異性免疫的方法之一，本實驗中20%的印度墨汁作為一種外來抗原，經小鼠尾靜脈注射進入血液循環，迅速流經肝臟與脾臟，墨汁碳粒會被單核吞噬細胞所清除，清除率可反映單核吞噬細胞的吞噬功能，吞噬指數越高，單核吞噬細胞的吞噬能力越強。周瓊等用環磷酰胺致低免疫力小鼠作為模型，再分別用低、中、高劑量的美洲大蠊粉給小鼠灌胃，研究蟲粉對小鼠吞噬細胞的吞噬指數、血清溶血素含量、外周血CD4/CD8和免疫器官指數的影響，結果表明，高劑量蟲粉組的血清溶血素含量和外周血CD4/CD8與模型對照組相比均有顯著提高（P＜0.05），中、高劑量蟲粉組吞噬細胞的吞噬指數比模型對照組顯著提高（P＜0.05），說明美洲大蠊蟲粉能提高低免疫力小鼠的免疫功能[7]。本試驗結果表明，3個給藥組廓清指數極顯著低于正常組，且吞噬指數顯著低于正常組，但3個劑量給藥組的廓清指數和吞噬指數均顯著高于模型組，其中以中劑量組效果最好。說明發酵中草藥200 mg·kg-1可以提高免疫抑制小鼠的廓清指數和吞噬指數，對CTX導致的免疫功能低下有一定的恢復作用。

4 結論

本試驗結果表明，發酵中草藥不同劑量均能夠顯著提高CTX造成的免疫低下小鼠脾臟指數和胸腺指數，同時降低血液中ALT、AST和BUN含量，顯著提高免疫抑制小鼠的廓清指數和吞噬指數，其中以中劑量組200 mg·kg-1添加效果最好。

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