銀杏葉中黃酮類物質(zhì)的酶法提取研究

張偉，張煥新，施帥

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300）

銀杏葉，形似扇，又像飛蛾或鴨腳形，江蘇泰州是我國(guó)銀杏四大主要產(chǎn)區(qū)之一，素有“銀杏之鄉(xiāng)”的美譽(yù)，栽植銀杏近800萬(wàn)株，占全國(guó)的三分之一。銀杏葉中含有160多種化學(xué)成分，其中黃酮類化合物、萜類內(nèi)酯被認(rèn)為是主要活性成分，銀杏酚酸為主要毒性成分[1]，黃酮類化合物具有極強(qiáng)的清除自由基能力和抗氧化能力，具有良好的防治心血管疾病的功效，因而受到國(guó)內(nèi)外的廣泛研究[2-3]。銀杏葉中黃酮類物質(zhì)主要包裹在細(xì)胞壁內(nèi)（由β-D-葡糖以1，4-β-葡糖苷鍵連接），傳統(tǒng)方法大多不能完全破碎細(xì)胞壁，限制了黃酮類物質(zhì)的溶出，嚴(yán)重影響了提取效率[4]。纖維素酶是一類復(fù)合酶，它能將組成細(xì)胞壁的纖維素骨架逐級(jí)降解成葡萄糖，進(jìn)而破壞細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞內(nèi)活性成分的溶出[5]。因此，本文擬探索纖維素酶法提取銀杏葉總黃酮的最佳工藝，以期提高提取得率，并進(jìn)一步探索銀杏葉提取物中黃酮類物質(zhì)的種類。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

銀杏葉：大佛指品系，采自江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院校內(nèi)；HCl、乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、NaOH、H3PO4、氯化鐵、磷酸、高硫酸鉀均為分析純：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素對(duì)照品、山奈酚對(duì)照品、異鼠李素對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所；纖維素酶（酶活35 000 IU/g）：Sigma中國(guó)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

JH722可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；Fw 177型中草藥粉碎機(jī)：上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；RE-52D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海青浦滬西儀器廠；Empower色譜工作站、Sunfire C18反相柱（4.6×150 mm，2.5 μm）、1525 μ 型二元泵、2996 紫外光檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝

新鮮銀杏葉經(jīng)過(guò)低溫烘干后，用中草藥粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱取2.0 g，酶水解后滅酶，加入乙醇溶液浸提24 h，冷藏后過(guò)濾，計(jì)算銀杏葉總黃酮提取得率。

1.2.2 酶解工藝

以酶解溫度、酶處理pH、酶濃度和酶解時(shí)間為4個(gè)考察因素，以銀杏葉總黃酮提取得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察各因素對(duì)銀杏葉總黃酮提取得率的影響，以確定酶處理的最佳條件。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Parameters and test levels for orthogonal experiment

1.2.3 銀杏葉中黃酮類物質(zhì)的測(cè)定方法

以蘆丁為標(biāo)樣，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[6-7]測(cè)定銀杏葉中黃酮類物質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：A=11.679C-0.00128，式中：C為蘆丁濃度，（mg/mL）；A為吸光度，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 4，在濃度為0 mg/mL～0.056 mg/mL范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系。

式中：C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的樣品的總黃酮濃度，（mg/mL）；V為樣品溶液的體積，mL；N為樣品的稀釋倍數(shù)；M為銀杏干葉質(zhì)量，mg。

1.2.4 銀杏葉提取物中黃酮種類的鑒定

移取銀杏葉提取物1 mL至50 mL的圓底燒瓶中，加入5 mL 25%的HCl溶液，在90℃水浴中回流加熱30 min。迅速冷卻，用甲醇定容至50 mL。用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾。

色譜條件：選用反相柱進(jìn)行洗脫。分析采用美國(guó)Waters公司1525μ型二元泵和2996型二極管陣列檢測(cè)器和Empower色譜工作站。

色譜柱為Waters公司的sunfire C18反相柱（4.6×150mm，2.5μm）。流動(dòng)相為A∶B=50∶50（體積比，A為100%的甲醇，B為0.4%H3PO4水溶液），流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為 10 μL。

在線進(jìn)行紫外檢測(cè)，200 nm～400 nm全掃描，分辨率1.2 nm。檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解工藝條件的確定

2.1.1 酶解溫度對(duì)銀杏葉總黃酮提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取2 g粉碎過(guò)篩的銀杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為4，酶濃度為 0.3 mg/mL，調(diào)節(jié)酶解溫度為 30、35、40、45、50、55、60℃，酶解 2 h后滅酶，70%乙醇定容、提取、過(guò)濾，計(jì)算銀杏葉總黃酮提取得率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酶解溫度對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.1 Effect of temperature on flavonoids extraction yield

由圖1可知，隨著溫度的升高，銀杏葉總黃酮提取得率增大，在45℃時(shí)達(dá)到最大值，50℃保持在相似水平略有下降，隨后，隨著溫度升高，總黃酮提取得率顯著下降，當(dāng)溫度達(dá)到55℃后，總黃酮提取得率隨溫度變化下降不明顯。這是由于纖維素酶在45℃～50℃之間有最大活力，同時(shí)也能保持較好的穩(wěn)定性，如溫度進(jìn)一步加大，由于蛋白質(zhì)變性，酶的活性降低，浸提效果反而變差。

2.1.2 酶處理pH對(duì)銀杏葉總黃酮提取得率的影響

溶液的pH影響著酶的活性，纖維素酶的活性中心偏酸性條件[8]。故準(zhǔn)確稱取2 g粉碎過(guò)篩的銀杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc緩沖溶液，調(diào)節(jié)酶解溫度為45℃，酶濃度為0.3 mg/mL，酶解2 h后滅酶，70%乙醇定容、提取、過(guò)濾，考察pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 時(shí)，銀杏葉總黃酮提取得率的變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 pH對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.2 Effect of pH on flavonoids extraction yield

由圖2可知，當(dāng)pH 4.5時(shí)，總黃酮提取得率最高，且呈現(xiàn)向兩邊遞減的趨勢(shì)。由于pH既能影響酶的構(gòu)象，也會(huì)影響底物的解離狀態(tài)，當(dāng)pH4.5時(shí)，纖維素酶活力最大，可最大限度的破壞細(xì)胞壁纖維素β-1，4葡萄糖苷鍵，使傳質(zhì)阻力減小，從而浸提效率最高[9]。

2.1.3 酶濃度對(duì)銀杏葉總黃酮提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取2 g粉碎過(guò)篩的銀杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc緩沖溶液，分別調(diào)節(jié)酶解溫度為45℃，酶解pH為4，調(diào)整酶濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mg/mL，酶解 2 h 后滅酶，70%乙醇定容、提取、過(guò)濾，分別計(jì)算銀杏葉總黃酮提取得率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酶濃度對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.3 Effect of enzyme consumption on flavonoids extraction yield

由圖3可知，酶濃度增大，總黃酮提取得率提高。但當(dāng)酶濃度增大到0.25 mg/mL時(shí)，總黃酮提取得率幾乎不再提高，保持在相似水平并略有波動(dòng)。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)銀杏葉總黃酮提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取2 g粉碎過(guò)篩的銀杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc緩沖溶液，調(diào)整pH為4、酶濃度為0.3 mg/mL，保持溫度為45℃，分別酶解0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 后滅酶，70%乙醇定容、提取、過(guò)濾，計(jì)算銀杏葉總黃酮提取得率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，銀杏葉總黃酮提取得率顯著增大，但當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到2 h后，銀杏葉總黃酮提取得率增加不明顯，因?yàn)槊附猱a(chǎn)物的濃度增加，抑制了水解過(guò)程。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on flavonoids extraction yield

2.1.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交法“均衡分散”的特點(diǎn)[10]，以酶解溫度、酶處理pH、酶濃度、酶解時(shí)間為考察因素，以銀杏葉總黃酮提取得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Result of L9（34）orthgonal test

由表2可知，各因素對(duì)銀杏葉總黃酮提取得率的影響依次是：酶解溫度＞酶濃度＞酶解時(shí)間＞酶處理pH。

采用SPSS 13.0 for windows對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表 3 可知，酶解溫度（p＜0.01）、酶濃度（p＜0.05）、酶解時(shí)間（p＜0.05）對(duì)銀杏葉總黃酮提取得率有顯著影響。酶處理pH對(duì)銀杏葉總黃酮提取得率影響很小，作為誤差項(xiàng)。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

根據(jù)銀杏葉總黃酮提取得率高的要求，本實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解條件為A2B1C3D2，即在酶解溫度為45℃、酶處理pH為4、酶濃度為0.3 mg/mL、酶解時(shí)間2 h時(shí)，銀杏葉總黃酮得率最高。根據(jù)最佳酶解條件，做3組驗(yàn)證性試驗(yàn)，同時(shí)做3組為未添加纖維素酶的空白試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 酶法提取與空白試驗(yàn)提取率比較Table 4 Comparison of extraction yield by cellulase and noncellulase

由表4可知，未添加纖維素酶的空白對(duì)照試驗(yàn)，黃酮類物質(zhì)提取平均得率為1.92%，而酶法提取試驗(yàn)，黃酮類物質(zhì)平均得率為2.80%，顯著提高了45.83%。對(duì)比試驗(yàn)表明：纖維素酶在銀杏葉總黃酮提取過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，隨著酶解進(jìn)程的推進(jìn)，纖維素酶不斷地將銀杏葉細(xì)胞壁裂解，促使包藏在細(xì)胞壁中的總黃酮不斷釋放出來(lái)，提高了總黃酮提取效率[11]。

2.2 銀杏葉提取物中黃酮種類的鑒定

銀杏葉提取物中黃酮類物質(zhì)的HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可以知，銀杏葉提取物中黃酮苷的3個(gè)峰與槲皮素，山奈酚，異鼠李素3個(gè)峰出峰時(shí)間一致，可以判斷為銀杏葉提取物中黃酮類物質(zhì)成分主要是槲皮素，山奈酚，異鼠李素及其相對(duì)應(yīng)的衍生物。

圖5 黃酮的高效液相分析圖譜Fig.5 The HPLC chromatogram of the flavonoid

3 結(jié)論

1）采用纖維素酶水解破壁，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了纖維素酶水解破壁的最佳工藝為：酶解溫度為45℃、酶處理pH為4、酶用量為0.3 mg/mL、酶解時(shí)間為2 h時(shí)，在此條件下，銀杏葉總黃酮提取得率為2.80%，比空白對(duì)照組顯著提高了45.83%。

2）通過(guò)比較銀杏葉提取物和黃酮苷元對(duì)照品的高效液相圖譜得出，銀杏葉提取物中黃酮類物質(zhì)主要是槲皮素、山奈酚和異鼠李素。

3）銀杏葉粗提物中除了含有黃酮類物質(zhì)之外，還含有大量的銀杏內(nèi)酯、銀杏多糖、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，可進(jìn)一步探索銀杏葉提取殘?jiān)鼉?nèi)銀杏內(nèi)酯、銀杏多糖和蛋白質(zhì)的提取利用，以增加銀杏葉的綜合利用度。

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