基于Ma t l a b的原料乳中金黃色葡萄球菌生長模型的分析

趙鑫，鞠世穎，周穎，劉濱，梁宏彰，高曉峰，鄭遂，霍貴成

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）已被全世界公認為食品加工過程中衛生條件較差和引起食品腐敗的主要原因[1]。葡萄球菌引起的食物中毒是由于攝入的食物中污染了耐熱的金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxin，SE）[2]，腸毒素僅在金黃色葡萄球菌達到105cfu/g的情況下才會產生[3]，如果食品在儲備期間周圍環境適合金黃色葡萄球菌的生長（例如時間和溫度）時，腸毒素將產生，并且給消費者帶來潛在的危害[4－5]。金黃色葡萄球菌的生長溫度范圍廣泛，在7℃～48.5℃都可生長，最適生長條件為30℃～37℃[6]，pH 4.0～10.0，耐鹽濃度可達25%，這些特性使得金黃色葡萄球菌有廣泛的生存空間，即使在較為惡劣的條件下也能存活很長時間。

在眾多S型曲線函數中，Logistic方程和Gompertz方程能有效描述微生物生長，在腐敗細菌生長動力學研究中被廣泛使用[7－8]。近年來，人工神經網絡（Artifi－cial Neural Network，ANN）逐漸被應用于科學研究，不同于其他非線性函數，ANN通過反復將輸入輸出模式提交給網絡來調節高度非線性的神經網絡結構，以便直接探索輸入輸出模式之間的關系[9]。

Matlab已被用于工程和科學研究中的諸多領域，它是一款在不同領域擁有多種專業工具箱的強大數學工具[10]，Matlab提供了一個實驗數據和電腦相連接的平臺，取代了復雜的專業算法，Matlab的一些基礎函數可被研究人員用于建立自己的Matlab工具箱，進而分析所得的實驗結果。

本文利用Matlab編寫程序，結合三種數學模型對金黃色葡萄球菌在12、25、37℃下的生長曲線進行擬合，并進行模型評價和分析，為原料乳的生產、運輸及儲藏過程中的金黃色葡萄球菌控制及檢測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳：市售。金黃色葡萄球菌標準菌株（ATCC 25923）：乳品科學教育部重點實驗室自存；3M快速金黃色葡萄球菌測試片：美國3M公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HPS-160生化培養箱：哈爾濱東聯電子技術開發有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌在原料乳中的培養及計數

參照GB4789.10-2010《食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》第三法，利用3M金黃色葡萄球菌測試片，對金黃色葡萄球菌的純培養物進行菌落計數，按照菌落計數結果取一定量菌液接種于符合要求的金黃色葡萄球菌陰性的巴氏滅菌乳中，取一定量的菌液離心盡量吸取上清液，用巴氏滅菌乳稀釋，使接種終濃度在102CFU/mL～103CFU/mL范圍內。將接種后的滅菌乳充分混勻后，以10 mL分裝于6個中試管中，兩管一組，然后分別置于12、25、37℃條件下進行培養。在12℃的情況下培養56 h，每4小時取1 mL樣品，25℃培養28 h，每2小時取1 mL樣品，37℃培養16 h，每1小時取1 mL樣品，每次計數用生理鹽水做3個倍數稀釋，取1 mL添加到金黃色葡萄球菌測試片上。每個稀釋度做兩個平行。然后將3M快速金黃色葡萄球菌測試片放于37℃條件下培養，（24±2）h后計數。

1.3.2 原料乳中金黃色葡萄球菌生長模型的建立

分別以時間 t和 ln（N(t)/N0）為橫、縱坐標，N0為初始菌數（CFU/mL），N(t)為 t時刻的細菌數，利用 Matlab分析不同溫度條件下原料乳中金黃色葡萄球菌的生長數據，并根據對函數式的推導，求解描述微生物生長曲線特性的 3 個參數（μm，λ，A）：最大比生長速率 μm（h-1）指對數期中拐點處的正切值，微生物生長的延滯期λ（h）是指該拐點處的切線與x軸的交點值，A=ln（Nmax/N0），Nmax是指穩定期微生物數量（cfu/mL）[11]，模型函數及三個參數推導見表1。

表1 模型的函數式及參數Table 1 Functional equations and their parameters

以時間t為輸入，ln（N(t)/N0）為輸出，建立兩層神經網絡神經網絡，第一層傳遞函數設置為tansig，第二層傳遞函數為purelin，網絡訓練函數為trainlm，其他均為默認缺省值，由于神經網絡與非線性回歸模型不同，不具有一定的函數表達式，無法求得（μm，λ，A）3 個參數，只能直觀的從圖像中表現出細菌的生長狀態。

1.3.3 模型評價

模型建立完成后，需要將實驗數據與預測值進行比較，以驗證模型的準確性和可行性，通常采用的評價方法及函數的意義如表2[12-21]。

表2 評價方法及意義Table 2 Evaluations method and their significance

1.3.4 基于Matlab2012a的3種模型程序代碼

1.3.4.1 Logistic和Gompertz模型

1.3.4.2 神經網絡程序代碼

利用本程序可直接從Excel中提取數據進行分析，將數據按時間為第一列，菌落計數結果為第二列存儲在文件名為“zx.xls”的Excel文件中，便于操作。

2 結果與討論

2.1 不同溫度下金黃色葡萄球菌在原料乳中的一級生長模型

圖1 原料乳中金黃色葡萄球菌的擬合曲線（37℃）Fig.1 Growth curves of Staphylococcus aureus in raw milk（37℃）

圖2 原料乳中金黃色葡萄球菌的擬合曲線（25℃）Fig.2 Growth curves of Staphylococcus aureus in raw milk（25 ℃）

圖3 原料乳中金黃色葡萄球菌的擬合曲線（12℃）Fig.3 Growth curves of Staphylococcus aureus in raw milk（12℃）

從圖1～圖3中可以直觀的發現金黃色葡萄球菌在37℃的條件下生長較為迅速在14 h后達到穩定狀態，而在25℃，即室溫條件下在20 h后趨于穩定，在12℃的情況下生長頗為緩慢，需36 h才能達到最大生長量。并且在12℃～37℃溫度范圍內最大生長量隨著溫度的增加而增加。根據對實驗數據的分析，在12、25、37℃條件下的Logistic模型穩定期時微生物數量A 分別為 1.9236、5.5581、7.9608；Gompertz模型穩定期時微生物數量 A分別為 1.9403、5.6158、8.1765。Logistic與Gompertz模型的函數式及微生物的最大比生長速率、延滯期時間見表3、4。

表3 Logistic模型及參數Table 3 Functional equation of Logistic and its parameters

表4 Gompertz模型及參數Table 4 Functional equation of Gompertz and its parameters

從表 3、4 中可以看出最大比生長速率 μm（h－1）隨著培養溫度的升高逐漸變大，但延滯期時間并沒有特定規律，這是因為菌液的活化時間不同所引起的，菌液的活化時間直接影響了菌液的生長活性，因此本文只采用最大比生長速率μm（h－1）建立二級模型。

表5為通過程序計算出的10種常用的針對函數擬合的評價函數值，本文以修正決定系數R2Adj，均方誤差MSE，預測標準誤差SEP為主對三種模型進行了對比（表5中斜體），其余7種可適當參考，針對不同需求選取不同的評價函數。修正決定系數R2Adj，對R2的進一步修正，避免了由于樣本大小和變量參數數目對擬合度的影響[14]，R2Adj的值越接近于1，預測模型對實驗數據的擬合度越高，從表5中R2Adj的值可以看出在12 ℃條件下，擬合度 Gompertz＞ANN＞Logistic，而在 25、37℃的條件下，ANN＞Gompertz＞Logistic，ANN 模型的R2Adj值為1，可見ANN在擬合函數方面的優越性；均方誤差MSE，適用于評價預測模型的優劣和數據的變化程度，MSE的值越小，說明模型的精確度越好[16]，根據表5數據可以發現在12℃的條件下Gompertz的精確度優于ANN，而在25、37℃這兩個溫度下精確度ANN＞Gompertz＞Logistic；預測標準誤差 SEP 是指預測模型預測值和實驗觀測值差異的標準偏差，可以用來衡量和驗證模型的準確度，SEP的值越小，說明模型對實驗數據的描述性越好，比較表5的數值可以看出，在12℃的條件下Gompertz優于ANN，但數值大小相差不多，而在25、37℃這兩個溫度下3個鐘模型的數值相差較為明顯，ANN＞Gompertz＞Logistic。通過對三種評價函數的比較我們可以得出結論在擬合度、精確度、準確度這3個方面，ANN即神經網絡均優于其他的兩種模型，但神經網絡也存在著一定的局限性，一是無函數表達式，無法對函數進行進一步的數學推導，二是存在過度擬合的局限性，一旦數據變化較大模型的形態將發生巨大變化，綜合以上述原因，本文考慮以Gompertz模型所求得的最大比生長速率 μm（h－1）建立二級模型，進一步描述最大比生長速率μm（h－1）與溫度之間的函數關系。

表5 評價方法的數值結果Table 5 The result of evaluations method

2.2 二級模型的建立

根據一級模型所求得的最大生長速率，利用Matlab2012a建立生長速率與溫度的平方根模型，程序代碼如下

圖4 最大比生長率μm與溫度間的關系Fig.4 Relationship of temperature with μm

所得擬合方程如下

方程相關系數為0.823 1，大于0.8說明相關性較強，模型的建立存在一定的意義。由該方程可推算出，在溫度為8.958 0℃時最大比生長速率為0，即在9℃以下金黃色葡萄球菌幾乎不生長。并且，在12℃～37℃范圍內，隨著溫度的升高金黃色葡萄球菌的最大生長率逐漸增加。

3 結論與討論

針對金黃色葡萄球菌的生長有很多影響因素，如溫度，pH，水活度等，但在原料乳中比較容易發生大范圍變化的主要是溫度，因此本文選取溫度進行研究，12℃為運送原料奶過程中的最高溫度，25℃為常溫，在原料乳的生產加工過程中比較常見，最后37℃為金黃色葡萄球菌生長的最適溫度，也是奶牛體溫，原料奶的初始溫度，選取這3個具有代表性的溫度關鍵點進行研究，大大提高了該研究的實用性。在模型的建立中，應用實驗數據的自然對數值使得模型的擬合效果更好[11]，并且以Matlab2012a為平臺編寫了模型的一級、二級程序及模型評價函數，解決了由于原料乳成分的復雜性而造成的生長模型存在較大差異的問題，為微生物生長模型的建立提供方便。

由以上的結果可以發現，針對金黃色葡萄球菌的一級生長模型，ANN的擬合特性最好（見表5），各評價函數均優于Gompertz和Logistic，但考慮到其過度擬合的性質和沒有函數表達式的缺點，最終確定以Gompertz的一級模型所求得的最大比生長率μm（h－1）建立金黃色葡萄球菌的二級模型，預測金黃色葡萄球菌的生長特性與溫度間的函數關系，在9℃～37℃范圍內金黃色葡萄球菌的最大比生長率隨溫度的升高而變大，對于9℃以下，金黃色葡萄球菌幾乎不生長。生長環境的不同可能導致金黃色葡萄球菌的生長特性發生一定變化，這也是二級模型的相關系數僅為0.823 1的原因，因此模型無法精確的反應金黃色葡萄球菌復雜的生長特性，但能反映微生物大體的生長趨勢，對乳制品生產過程中病原菌的檢測有一定的指導意義。

[1] Soriano J M,Font G,Moltó J C,et al.Enterotoxigenic staphylococci and their toxins in restaurant foods[J].Trends in Food Science&Technology,2002,13(2):60－67

[2] Scherrer D,Corti S,Muehlherr J E,et al.Phenotypic and genotypic characteristics of Staphylococcus aureus isolates from raw bulktank milk samples of goats and sheep[J].Veterinary Microbiology,2004,101(2):101－107

[3] Notermans S,Heuvelman C J.Combined Effect of Water Activity,pH and Sub－optimal Temperature on Growth and Enterotoxin Production of Staphylococcus aureus[J].Journal of Food Science,1983,48(6):1832－1835

[4] Notermans S,Van Otterdijk R L M.Production of enterotoxin A by Staphylococcus aureus in food[J].International Journal of Food Microbiology,1985,2(3):145－149

[5] Todd E C D,Greig J D,Bartleson C A,et al.Outbreaks where food workers have been implicated in the spread of foodborne disease.Part 4.Infective doses and pathogen carriage[J].Journal of Food Protection,2008,71(11):2339－2373

[6] Schmitt M,Schuler－Schmid U,Schmidt－Lorenz W.Temperature limits of growth,TNase and enterotoxin production of Staphylococcus aureus strains isolated from foods[J].International journal of food microbiology,1990,11(1):1－19

[7] Dalgaard P,Vancanneyt M,Euras Vilalta N,et al.Identification of lactic acid bacteria from spoilage associations of cooked and brined shrimps stored under modified atmosphere between 0℃and 25℃[J].Journal of applied microbiology,2003,94(1):80－89

[8] Koutsoumanis K,Nychas G J E.Application of a systematic experimental procedure to develop a microbial model for rapid fish shelf life predictions[J].International Journal of Food Microbiology,2000,60(2):171-184

[9] Hajmeer M,Basheer I,Cliver D O.Survival curves of Listeria monocytogenes in chorizos modeled with artificial neural networks[J].Food microbiology,2006,23(6):561-570

[10]Chapman S J.MATLAB programming for engineers[M].Cengage Learning,2008

[11]Zwietering M H,Jongenburger I,Rombouts F M,et al.Modeling of the bacterial growth curve[J].Applied and environmental microbiology,1990,56(6):1875-1881

[12]Karunakaran K,Thamilarasu P,Sharmila R.Statistical study on physicochemical characteristics of groundwater in and around Namakkal,Tamilnadu,India[J].Journal of Chemistry,2009,6(3):909-914

[13]Ding T,Rahman S M E,Purev U,et al.Modelling of Escherichia coli O157:H7 growth at various storage temperatures on beef treated with electrolyzed oxidizing water[J].Journal of Food Engineering,2010,97(4):497-503

[14]Snedecor G W,Cochran W G.Statistical methods[M].8th ed.Iowa:Iowa University Press,1989:360-362

[15]Huang L.Thermal inactivation of Listeria monocytogenes in ground beef under isothermal and dynamic temperature conditions[J].Journal of food engineering,2009,90(3):380-387

[16]Cayré M E,Vignolo G,Garro O.Modeling lactic acid bacteria growth in vacuum-packaged cooked meat emulsions stored at three temperatures[J].Food microbiology,2003,20(5):561-566

[17]Lebert I,Robles-Olvera V,Lebert A.Application of polynomial models to predict growth of mixed cultures of Pseudomonas spp.and Listeria in meat[J].International Journal of Food Microbiology,2000,61(1):27-39

[18]Ross T.Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology[J].Journal of applied microbiology,1996,81(5):501-508

[19]Oscar T P.Response surface models for effects of temperature,pH,and previous growth pH on growth kinetics of Salmonella typhimurium in brain heart infusion broth[J].JournalofFoodProtection,1999,62(2):106-111

[20]Bang W S,Chung H J,Jin S S,et al.Prediction of Listeria monocytogenes growth kinetics in sausages formulated with antimicrobials as a function of temperature and concentrations[J].Food Sci Biotechnol,2008,17(6):1316-1321

[21]Dong Q,Tu K,Guo L,et al.Response surface model for prediction of growth parameters from spores of Clostridium sporogenes under different experimental conditions[J].Food microbiology,2007,24(6):624-632