低氧對(duì)人喉鱗癌Hep－2細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制探討

董凱峰，張翠紅，宋冬梅，呂 欣，張繼華，薛海濤，趙玉玲，牛英豪

(1河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031;2白求恩國(guó)際和平醫(yī)院)

腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，常處于缺血、低氧微環(huán)境狀態(tài)。研究證實(shí)，低氧誘導(dǎo)因子α(HIF-1α)是調(diào)控腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境的核心因子，可誘導(dǎo)多種基因表達(dá)，是參與細(xì)胞凋亡的重要因子之一［1］。近來(lái)研究表明，賴氨酰氧化酶(LOX)在不同腫瘤組織及惡性腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)既有上調(diào)又有下調(diào)。結(jié)果證實(shí)，LOX可能具備雙重功能，即抑制或促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［2，3］，目前具體作用機(jī)制尚不明確。2013年2～7月，我們觀察了低氧對(duì)人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞凋亡的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Hep-2細(xì)胞(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科凍存)，RPMI1640培養(yǎng)基(Gibico公司);鼠抗人HIF-1α、LOX抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，RNA提取試劑(Invitrigen公司)，cDNA合成試劑盒及擴(kuò)增試劑盒(北京Trans gene公司)，上、下游引物合成(北京全式金生物公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組與培養(yǎng) 將Hep-2細(xì)胞在37℃、5%CO2、20%O2環(huán)境中培養(yǎng)12 h，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后隨機(jī)分為常氧組及低氧組。低氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)條件為 2%O2、5%CO2、93%N2、37 ℃，具體實(shí)驗(yàn)裝置制作見(jiàn)參考文獻(xiàn)［2］;常氧組原環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后收集兩組細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.2 細(xì)胞凋亡觀察 采用流式細(xì)胞儀(FCM)。檢測(cè)時(shí)隨機(jī)抽取待測(cè)標(biāo)本的一部分細(xì)胞，將這部分細(xì)胞作為隨機(jī)樣本進(jìn)行分析;首先測(cè)出樣本細(xì)胞總數(shù)，再測(cè)得其中凋亡細(xì)胞占該樣本細(xì)胞總數(shù)的百分率，即細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 HIF-1α、LOX 蛋白檢測(cè) 采用 Western blot法。收取核蛋白及總蛋白，常規(guī)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉;一抗4℃過(guò)夜，次日二抗孵育顯色。Lab work2.0軟件分析蛋白 IOD值，以 HIF-1α(LOX)與Actin的百分比表示 HIF-1α(LOX)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 HIF-1α、LOX mRNA 檢測(cè) 采用 RT-PCR法。Trizol法提取總 RNA，β-actin作內(nèi)參，每例樣本重復(fù)5次。人HIF-1α、LOX mRNA PCR引物序列及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［3］。Lab work2.0軟件分析IOD值，以HIF-1α(LOX)與β-actin的百分比表示HIF-1α(LOX)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn);相關(guān)關(guān)系采用Person相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞凋亡情況比較 常氧組細(xì)胞凋亡率為13.86% ±0.12%，低氧組為 5.13% ±0.67%，P＜0.05。

2.2 兩組細(xì)胞中HIF-1α、LOX蛋白表達(dá)比較 低氧組細(xì)胞中HIF-1α、LOX蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為28.34% ±0.86%、48.21% ±2.02%，常氧組分別為16.03% ±1.11%、36.21% ±1.02%，P 均 ＜0.05。見(jiàn)圖1。低氧組細(xì)胞中HIF-1α與LOX蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.862，P ＜0.05)。

圖1 兩組細(xì)胞中HIF-1α、LOX蛋白表達(dá)

2.3 兩組細(xì)胞中HIF-1α、LOX mRNA表達(dá)比較低氧組細(xì)胞中HIF-1α、LOX mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為29.12% ± 1.24%、37.32% ±0.64%，常氧組分別為21.02% ±0.21%、35.43% ±1.41%，P 均 ＜0.05。見(jiàn)圖2。低氧組細(xì)胞中 HIF-1α與LOX mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.862，P ＜0.05)。

圖2 兩組細(xì)胞中HIF-1α、LOX mRNA表達(dá)

3 討論

局部低氧是腫瘤微環(huán)境的一個(gè)重要特征。業(yè)已證實(shí)，HIF是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧的關(guān)鍵因子。其主要在低氧條件下激活表達(dá)，是調(diào)節(jié)低氧反應(yīng)性基因表達(dá)的共同通路;其可誘導(dǎo)多種基因表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，給腫瘤治療帶來(lái)巨大困難［4，5］。低氧微環(huán)境的腫瘤細(xì)胞具有高轉(zhuǎn)移性及耐藥性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性腫瘤難以治愈。HIF可在不同程度的低氧微環(huán)境下以不同形式存在，不同實(shí)驗(yàn)(生理或病理)條件或不同細(xì)胞中通過(guò)不同的機(jī)制對(duì)細(xì)胞發(fā)揮促凋亡或抗凋亡的作用［6～8］。本研究結(jié)果表明，低氧可以一定程度上抑制Hep-2細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。

LOX可作用在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的膠原和彈性纖維并催化系列反應(yīng)，最終形成膠原及彈性纖維間的共價(jià)交聯(lián)［9，10］，其產(chǎn)生與活性在維系ECM的發(fā)育、成熟及結(jié)構(gòu)完整性方面發(fā)揮重要作用［11，12］。有研究顯示，LOX表達(dá)可能與人類腫瘤細(xì)胞低氧環(huán)境有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LOX啟動(dòng)子為功能性的低氧反應(yīng)元件，HIF-1通過(guò)這個(gè)低氧反應(yīng)元件可在mRNA水平誘導(dǎo)LOX表達(dá)上調(diào)。一些關(guān)于頭頸部腫瘤和乳腺癌患者的臨床研究證實(shí)，LOX表達(dá)水平與腫瘤低氧有明確的相關(guān)性。近期研究指出，LOX由HIF-1調(diào)控，同時(shí)LOX高表達(dá)的腫瘤患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移幾率增大，生存率降低。還有研究表明，抑制LOX能降低乳腺癌在小鼠身上的轉(zhuǎn)移幾率［13～15］。

本研究結(jié)果表明，低氧能明顯增加Hep-2細(xì)胞HIF-1α蛋白及其mRNA表達(dá)，同時(shí)LOX蛋白及其mRNA表達(dá)相應(yīng)上調(diào);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，常氧組與低氧組相比Hep-2細(xì)胞凋亡率低。推測(cè)腫瘤內(nèi)的低氧微環(huán)境導(dǎo)致HIF-1α蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而可能調(diào)控LOX蛋白表達(dá);同時(shí)推斷HIF-1α 可能通過(guò)調(diào)節(jié)LOX表達(dá)促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，在喉癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。提示可將HIF-1α及LOX作為治療喉癌的一個(gè)新靶點(diǎn)，通過(guò)增加腫瘤的氧供來(lái)提高療效。

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