c-myc、HIF-1α在骨巨細胞瘤組織中的表達及其與臨床、生物學行為的關系

馬 琨，郭建剛

(河南省洛陽正骨醫院，河南洛陽471002)

骨巨細胞瘤(GCTB)是常見且具有潛在惡性的骨腫瘤，大塊切除是其治療的理想方案，但其術后侵襲性生長和復發率為40% ～50%，且易發生肺轉移。研究表明，原癌基因c-myc表達升高在腫瘤發生、發展中起重要作用。腫瘤的演進和轉移依賴于新生血管生成，c-myc可調控下游基因缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)［1］，促進下游血管內皮生長因子(VEGF)表達，誘導腫瘤血管形成，促進實體腫瘤自身的生長、轉移和化療耐藥［2］。目前，有的學者將c-myc和HIF-1α作為評估乳腺癌等實體瘤生物學行為和預后的標志物［3］，但二者在GCTB組織中是否呈高表達、其表達是否與腫瘤進展有關，國內外報道甚少。為此，我們對c-myc、HIF-1α在GCTB組織中的表達及其與臨床、生物學行為的關系進行了初步研究。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2006～2013年在我院行GCTB手術的80例患者的病理標本，男54例、女26例，年齡18～60歲、平均48.3歲。病變位于股骨下端34例、脛骨上端25例、橈骨遠端12例、橈骨近端4例、骶骨3例、骨盆2例，均經臨床、病理、X線聯合檢查確診。Campanacci影像學分期為Ⅰ期18例，Ⅱ期34例，Ⅲ期28例;治愈65例，復發15例。除2例復發后失訪外，均獲隨訪，隨訪時間平均60個月。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 取患者的GCTB組織蠟塊4 μm行連續切片，進行免疫組化染色。主要步驟:腫瘤組織石蠟切片，58℃烤片過夜;常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化;檸檬酸鹽行高溫、高壓抗原修復;3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，分別滴加c-myc、HIF-1α、CD34單克隆抗體，室溫孵育1 h;滴加生物素標記二抗孵育15 min;DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。免疫組化試劑均為福州邁新生物公司產品。

1.2.2 結果判斷標準 c-myc主要定位在細胞核或細胞質，呈棕黃色或棕褐色。HIF-1α主要定位于細胞核，出現棕黃色或棕褐色顆粒樣物質為陽性。高倍鏡下隨機觀察5個視野，每個視野觀察細胞數不少于200個。根據細胞核染色強度及染色細胞百分率進行評分:①染色強度:基本不著色為0分，著淡黃色為1分，著棕黃色為2分，著棕褐色為3分。②陽性細胞所占百分率:≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為 3分，≥75%為4分。每張切片染色強度得分與陽性細胞百分率得分相乘為其最后得分，0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，≥6分為強陽性(+++)。采用CD34單抗標記新生血管內皮，CD34陽性判斷為細胞膜和細胞質著深棕色顆粒。微血管密度(MVD)計數:GCTB內任何一個孤立的棕黃色細胞或細胞簇均認為是一條單獨血管，先在低倍視野內找到腫瘤組織內微血管最豐富區域，即腫瘤內微血管的“熱點”，再于高倍視野下計數3個視野內的微血管數目，取其平均值進行分析。

1.2.3 統計學方法 采用 SPSS12.0統計軟件，計量數據用±s表示，組間比較用單因素方差分析，多重比較用t檢驗，等級資料比較行秩和檢驗，HIF-1α、c-myc表達與MVD值行Spearman等級相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 c-myc、HIF-1α表達與 GCTB患者臨床病理參數的關系 見表1。c-myc陽性物質主要表達于細胞核和(或)細胞質，HIF-1α陽性物質呈棕黃色顆粒狀，主要表達于細胞核。患者的c-myc、HIF-1α陽性表達率分別為55%(44/80)、50%(40/80)。

表1 c-myc、HIF-1α表達與GCTB患者臨床病理參數的關系［例(%)］

2.2 HIF-1α表達強度與MVD計數的關系 CD34陽性表達定位于腫瘤間質小血管及微血管內皮細胞胞質中，CD34陽性細胞可見瘤組織中的微血管為單個或成簇出現。HIF-1α表達陰性、陽性者GCTB組織中的 MVD 計數分別為(28.47 ±4.31)、(46.85 ±7.72)個/mm2，其中 HIF-1α 表達(－ )、(+)、(++)、(+++)者分別為 40、13、16、11 例，其 GCTB 組織中的 MVD 計數分別為(28.47 ±4.31)、(37.29 ±7.62)、(48.58 ± 6.97)、(54.69 ± 8.59)個/mm2;HIF-1α表達(++)、(+++)者的 MVD數目高于(－)、(+)者，P 均 ＜0.05;HIF-1α 表達強度與MVD 值呈高度正相關(r=0.996，P ＜0.01)。

2.3 HIF-1α、c-myc表達強度與GCTB患者預后的關系 見表2。

表2 HIF-1α、c-myc表達強度與GCTB患者預后的關系

3 討論

研究發現，GCTB經過外科手術治療后仍有20% ～50%的復發率，部分患者可發生肺轉移［4］。近年來，評估GCTB生物學行為和判斷其預后的可靠腫瘤標志物成為臨床研究的熱點。c-myc蛋白是由myc家族編碼的轉錄因子，人類c-myc基因定位于Ⅷ染色體上，由3個外顯子及2個內含子組成。Ⅰ外顯子只起調節作用，Ⅱ、Ⅲ外顯子是轉譯區，編碼包含439個氨基酸殘基的蛋白質。該基因表達在細胞生長調控中發揮雙向作用，既可刺激細胞增殖，也可促進細胞凋亡。李灼日等［5］研究表明，c-myc表達特征可反映膽管癌的生物學行為和惡性程度。林稱意等［6］研究表明，c-myc表達強度是判斷食管癌細胞過度分化及術后復發的關鍵指標。本研究顯示:①c-myc在GCTB組織中的表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小及發病部位無統計學差異，提示上述參數不能作為判斷GCTB侵襲及復發的指標。②隨著Companacci分期逐漸增高，c-myc表達逐漸升高，其中Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅰ期與Ⅲ期比較均有統計學差異，且復發者的陽性表達率高于治愈者;提示c-myc可促進GCTB細胞增殖，并與腫瘤復發、轉移及預后不良有密切關系。有學者對骨肉瘤患者的組織標本進行c-myc原位雜交并作臨床隨訪，發現c-myc表達陽性率為80%，其中肺轉移死亡者的陽性率高于存活3年以上者;提示c-myc過度表達與間葉來源腫瘤的發生、發展有關，其在分化差的區域表達較高，而在分化較好的區域表達則相反［7］。

實體性腫瘤的生長依賴于血管的生成，豐富的血管可為其提供營養物質條件，但腫瘤細胞增殖過快而血運無法滿足其生長需求時，就會形成局部缺氧的微環境，在腫瘤內部出現為耐受缺氧而表達的HIF。HIF是一種雙聚復合體，有 HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α三個亞型，由不同的基因編碼。低氧時HIF-1α與缺氧反應元件結合，可提高VEGF mRNA的穩定性，促進VEGF表達上調，增加供血、供氧、供能，改善惡性腫瘤因組織增生過快造成的局部組織缺氧及供能與耗能失衡，促進腫瘤生長和轉移［8］。另外，某些化療藥在氧分壓正常時也促進HIF-1α累積，使細胞耐藥［9］。本研究顯示:①HIF-1α在GCTB組織中的表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小及發病部位無統計學差異，提示上述參數不能作為判斷GCTB侵襲及復發的指標。②HIF-1α陽性率為50%，Companacci影像學分期越高，其HIF-1α陽性率越高，且復發者的陽性率高于治愈者。提示HIF-1α表達強度與GCTB細胞的生長、浸潤、轉移有關。HIF-1α可能通過以下途徑調節細胞生物學行為:①HIF-1α與缺氧反應元件中的共有序列結合，在轉錄水平上增加VEGF表達，提高VEGF mRNA的穩定性，上調VEGF蛋白表達水平，增加供血、供氧、供能，促進腫瘤生長、轉移［10］;②抑制成骨細胞分化;③誘導其下游因子 IL-6和 TNF-α，通過 OPG/RANK/RANKL系統加速破骨細胞生成，促進骨吸收和骨破壞［11］。

HIF-1α是c-myc的下游調節物，c-myc通過調控HIF-1α參與腫瘤新生血管形成，對腫瘤細胞的生長和轉移發揮促進作用［12］。本研究發現，c-myc、HIF-1α與CD34在GCTB組織中的表達呈正相關，復發者的c-myc、HIF-1α雙陽性表達率高于治愈者。由此可見，HIF-1α與c-myc存在調節機制，兩者在促進GCTB進展中可能發揮協同作用，可作為評估GCTB生物學行為和判斷患者預后的重要指標。

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