雷公藤甲素對高糖刺激足細胞轉分化的影響

趙小麗，徐建偉，劉麗秋

(1青島大學醫學院，山東青島266021;2青島市第八人民醫院;3青島大學附屬醫院)

糖尿病腎病是終末期腎臟病的常見原因。近年研究顯示，高糖環境可誘導足細胞發生上皮細胞—間充質細胞轉分化，可能在糖尿病腎病發生發展中發揮重要作用［1，2］。足細胞轉分化的機制尚未明確，研究發現轉化生長因子(TGF)/Smad通路是介導轉分化的重要信號轉導通路。雷公藤甲素(TP)能明顯減少糖尿病鼠蛋白尿，減輕腎小球肥大及足細胞損傷，可以通過調節Smad信號途徑減輕腎臟纖維化程度［3］。2012年3月～2013年4月，我們觀察了TP對高糖刺激小鼠足細胞轉分化及Smad信號表達的影響，探討TP的腎臟保護作用及可能機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠永生化足細胞系MPC5由山東大學藥理實驗室培養，山東大學中心實驗室轉贈。TP由上海融禾醫藥科技發展有限公司提供，純度＞99%。RPMI-1640培養基、胰蛋白酶和胎牛血清購自Hyclone公司，重組小鼠γ-干擾素購自Peprotech公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，引物由上海生工公司合成，RT-PCR試劑盒與SYBR Premix Ex Taq購自大連寶生物工程有限公司，兔抗Smad3、Smad7多克隆抗體購自Abcam公司，兔抗結蛋白(Desmin)抗體購自Santa Cruz公司，兔抗突觸極蛋白(Synaptopodin)抗體、兔抗GAPDH抗體和HRP標記山羊抗兔IgG購自北京博奧森公司。

1.2 足細胞培養與干預 參照文獻［4］方法培養足細胞。細胞復蘇后置于含10%胎牛血清、10 U/mL γ-干擾素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液中，33℃、5%CO2細胞培養箱中培養，隔天換液。3 d后轉入不含γ-干擾素的10%胎牛血清1640培養液中，37℃培養10～14 d，待細胞分化成熟后使用。將成熟的細胞以5×105/mL的密度接種于25 cm2的培養瓶中，待細胞融合至70% ～80%時，于無血清的培養液中饑餓24 h使細胞同步化。細胞分為五組，分別加入下列試劑:正常組加入D-葡萄糖5.5 mmol/L，高糖組加入D-葡萄糖30 mmol/L，TP低劑量組加入D-葡萄糖30mmol/L+TP 3 ng/mL，TP高劑量組加入D-葡萄糖30 mmol/L+TP 10 ng/mL，甘露醇組加入D-葡萄糖5.5 mmol/L+甘露醇24.5 mmol/L。各組干預時間均為48 h。

1.3 觀察指標

1.3.1 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin mRNA表達 采用熒光定量PCR法。按照Trizol試劑說明書提取各組細胞總RNA，然后利用260 nm的吸光度測定OD值和RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA。逆轉錄條件:37℃ 15 min，85℃ 5 s。按照 SYBR Premix Ex Taq說明書Light Cycler Real Time PCR擴增儀上進行SYBR GreenⅠ實時定量PCR反應，反應條件為:95℃ 30 s預變性，然后95℃ 5 s，60℃ 30 s重復40個循環。每個樣品設2個復孔，同時設無模板陰性對照。Smad3引物序列F:5'-GTCAACAAGTGGTGGCGTGTG-3'，R:5'-GCAGCAAAGGCTTCTGGGATAA-3'，擴增產物長度150 bp。Smad7引物序列F:5'-TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC-3'，R:5'-AGTAAGGAGGAGGGGGAGAC-3'，擴增產物長度165 bp。Synaptopodin引物序列 F:5'-AGACGACAGTTTGGAGAGAAGG-3'，R:5'-GCTGGGATACAGAGTGGAGTAA-3'，擴增產物長度255 bp。Desmin引物序列 F:5'-TGCAGCCACTCTAGCTCGTA-3'，R:5'-GACATGTCCATCTCCACCTG-3'，擴增產物長度150 bp。GAPDH引物序列F:5'-CTCATGACCACAGTCCATGC-3'，R:5'-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3'，擴增產物長度201 bp。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定產物特異性。以GAPDH為內參基因，以正常組為對照，采用2－△△CT法測定 Smad3、Smad7、Synaptopodin、DesminmRNA 相 對 表 達 量，ΔCt=(Ct目的基因－Ct管家基因)實驗組－(Ct目的基因－Ct管家基因)正常組。以上實驗均重復3次。

1.3.2 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin 蛋白表達 采用Western blot法。收集各組細胞，提取蛋白于95℃變性5 min。取上清，各組蛋白和Marker分別上樣，10%SDS-聚內烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉封閉后以兔抗 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin、GAPDH 多克隆抗體分別4℃孵育過夜(分別按1∶600、1∶600、1∶200、1∶500、1∶1 000 稀釋)。洗膜后用辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，ECL顯影，凝膠成像系統分析，Quantity One4.6.2掃描各組光密度值，以 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin 條帶與內參GAPDH條帶的光密度值比值代表各蛋白的相對表達量。以上實驗均重復3次。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin mRNA表達 TP低劑量組、TP高劑量組 Smad3、Desmin mRNA表達低于高糖組(P＜0.05)，Smad7、Synaptopodin mRNA表達高于高糖組(P＜0.05)，正常組與甘露醇組相比，各因子表達量差異無統計學意義。見表1。

2.2 各組 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin 蛋白表達 與正常組比較，高糖組足細胞Smad3、Desmin表達增多、Smad7、Synaptopodin表達減少(P＜0.05)。TP低劑量組、TP高劑量組、甘露醇組足細胞Smad3、Desmin蛋白表達低于高糖組(P＜0.05)，Smad7、Synaptopodin蛋白表達高于高糖組(P＜0.05)，正常組與甘露醇組相比，各因子表達量差異無統計學意義。見圖1、表2。

3 討論

蛋白尿不僅是糖尿病腎病的重要臨床特征，其持續存在也是加速糖尿病腎病進展的危險因素之一。足細胞作為腎臟濾過屏障的重要組成部分，其結構和功能異常是蛋白尿發生的重要原因。近年研究顯示，腎小球濾過屏障結構和功能的改變，尤其是足細胞及其相關蛋白的改變與蛋白尿的產生和發展密切相關，可能在糖尿病腎病的發生與進展過程中起重要作用。研究發現，足細胞在許多病理狀態下可以發生轉分化，出現間充質標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Desmin、纖連蛋白(FN)等表達上調，發生轉分化的足細胞易于從基底膜上脫落，造成濾過屏障的不完整，導致蛋白尿的形成［5］。

表1 各組Smad3、Smad7、Synaptopodin及Desmin mRNA相對表達量比較(±s)

表1 各組Smad3、Smad7、Synaptopodin及Desmin mRNA相對表達量比較(±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，△P ＞0.05;與高糖組比較，﹟ P ＜0.05

Smad3 Smad7 Synaptopodin Desmin正常組組別1.01 ±0.21 1.01 ±0.19 1.01 ±0.18 1.00 ±0.04高糖組 4.45 ±0.26* 0.28 ±0.06* 0.32 ±0.05* 4.27 ±0.16*TP低劑量組 3.14±0.14*﹟ 0.59±0.11*﹟ 0.45±0.11* 3.27±0.01*﹟TP高劑量組 1.73±0.15*﹟ 0.80±0.14*﹟ 0.67±0.17*﹟ 1.68±0.13*﹟甘露醇組 0.96±0.14△﹟ 1.03±0.15△﹟ 0.94 ±0.18△﹟ 1.07±0.05△﹟

圖1 各組足細胞Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin蛋白表達

表2 各組Smad3、Smad7、Synaptopodin及Desmin蛋白表達比較(相對表達量，±s)

表2 各組Smad3、Smad7、Synaptopodin及Desmin蛋白表達比較(相對表達量，±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，△P ＞0.05;與高糖組比較，﹟ P ＜0.05

Smad3 Smad7 Synaptopodin Desmin正常組組別0.20 ±0.02 0.79 ±0.07 0.78 ±0.09 0.35 ±0.03高糖組 0.77 ±0.10* 0.29±0.05﹡ 0.38±0.03﹡ 0.65±0.03﹡TP 低劑量組 0.57±0.02*﹟ 0.59±0.04*﹟ 0.49±0.02* 0.56±0.02*﹟TP 高劑量組 0.36±0.02*﹟ 0.64±0.05*﹟ 0.60±0.02*﹟ 0.47±0.06*﹟甘露醇組 0.23 ±0.04△﹟ 0.80±0.05△﹟ 0.83±0.07△﹟ 0.33±0.02△﹟

目前足細胞轉分化的機制尚未明確。TGFβ/Smad信號通路是介導腎臟纖維化最重要的信號轉導途徑，TGFβ1通過結合并激活具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的跨膜受體，進而催化其下游信號分子Smads磷酸化而發揮生物學作用［6，7］。糖尿病腎病時TGFβ1表達增加并激活其下游Smad2、Smad3，介導腎小管上皮轉分化及腎臟纖維化發展［8］。Samd7是TGFβ/Smad信號通路重要的負反饋抑制因子，可以通過拮抗 TGFβ/Smad通路而發揮腎臟保護作用［9］。研究證實下調 Smad3的表達及上調Smad7的表達可以抑制腎小管上皮細胞轉分化［10，11］。我們前期研究發現，體外給予高糖刺激可下調足細胞Smad7表達，促進足細胞轉分化，提示Smad蛋白表達異常可能是足細胞發生轉分化的重要機制［12］。Synaptopodin是一種富含脯氨酸的肌動蛋白結合蛋白，表達于分化成熟的足細胞。Desmin是O-唾液酸糖蛋白家族成員，其大量表達提示足細胞發生轉分化。本研究發現，與正常組比較，高糖組足細胞Smad3、Synaptopodin mRNA及蛋白表達增多，Smad7、Desmin mRNA及蛋白表達減少，提示高糖刺激可以在轉錄水平和蛋白水平上調節足細胞Smad3表達，下調Smad7表達，并且使成熟足細胞標志物Synaptopodin表達減少，而間充質標志物Desmin表達增多;正常組與甘露醇組相比，足細胞 Smad3、Smad7、Desmin、Synaptopodin表達量的差異無統計學意義，提示高糖刺激而非高滲刺激可以影響足細胞Smad蛋白表達，誘導足細胞轉分化。

雷公藤具有免疫抑制、抗炎及抗腫瘤的作用，在多種腎小球疾病，如微小病變、局灶節段性腎小球硬化和膜性腎病的治療中顯示了獨特的功效。TP是雷公藤有效成分之一，對Heymann腎炎具有顯著的治療作用，能有效減少蛋白尿，減輕腎組織免疫損傷，促進足細胞病變和裂孔膜蛋白結構的修復［13］。研究表明TP可以通過抑制系膜細胞Smad3的表達及核轉位，上調Smad7，抑制TGFβ1誘導的腎小球系膜細胞的增殖，減輕腎臟纖維化，還可以通過上調Ski，抑制 TGFβ1、Smad3 的表達，改善單側輸尿管梗阻大鼠腎臟纖維化，提示TP可以通過調節Smad蛋白的表達抑制腎臟纖維化過程。本研究發現，TP低劑量組、TP高劑量組足細胞Smad3、Desmin mRNA及蛋白表達均低于高糖組，Smad7、Synaptopodin mRNA及蛋白表達均高于高糖組，提示TP干預可以抑制高糖刺激誘導的Smad3、Smad7表達異常，部分恢復Synaptopodin表達，減少Desmin表達，從而調節足細胞TGFβ/Smad信號通路而抑制足細胞轉分化。

綜上所述，TP可以在轉錄水平和蛋白水平抑制高糖刺激的足細胞Smad3表達，上調Smad7表達，并抑制足細胞轉分化，為TP應用于臨床治療糖尿病腎病提供了理論依據。

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