睡眠剝奪對大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突組織p38信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

馬 川，陳虹瑜，曲竹麗，趙華強

(1山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，濟南250012;2山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點實驗室;3濟南市口腔醫(yī)院;4山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校)

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(TMD)是咀嚼肌疼痛和顳下頜關(guān)節(jié)(TMJ)破壞的疾病總稱，是口腔科的常見疾?。?］。研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪在TMJ破壞中起重要作用［2］。p38信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要組成部分，p38上游的MKK6蛋白是活化p38的激酶［3］。研究發(fā)現(xiàn)p38信號通路在膝、踝等大關(guān)節(jié)破壞過程中起重要作用［4］;但其在TMJ關(guān)節(jié)破壞中的作用鮮見報道。2012年11月～2013年10月，我們觀察了睡眠剝奪大鼠TMJ關(guān)節(jié)髁突組織中p38和MKK6的表達，探討p38通路在睡眠剝奪引起TMD破壞中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:40只Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量(130±10)g，一級，由山東大學(xué)實驗動物中心提供;均飼養(yǎng)于恒溫房間;隨機分為睡眠剝奪組(SD組)及對照組，每組各20只。試劑與儀器:磷酸化-p38(P-p38)兔抗大鼠多克隆抗體(北京康為世紀生物科技有限公司);磷酸化-MKK6(P-MKK6)兔抗大鼠多克隆抗體(北京康為世紀生物科技有限公司);免疫組化SP染色試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司);多平臺睡眠剝奪模型(濟南軍區(qū)總醫(yī)院動物中心制作);曠場試驗箱(濟南軍區(qū)總醫(yī)院動物中心制作);石蠟切片機(THERMO，美國);光學(xué)顯微鏡(BX51，日本OLYMPUS公司);激光共聚焦顯微鏡(LEICA TCS SP5，德國 LEICA公司);Image Pro-plus 6.0圖像分析軟件(美國Media Cybemetics公司)。

1.2 睡眠剝奪模型制作及效果評估

1.2.1 模型制作 制作實驗用水槽2個，長、寬、高分別為110 cm×70 cm×40 cm，水槽內(nèi)注滿水。SD組所用水槽內(nèi)有15個直徑6.3 cm的小平臺(水槽1)，高于水面約1.0 cm;對照組所用水槽內(nèi)有一直徑為16 cm的大平臺(水槽2)。SD組參照改良多平臺法［5］建立睡眠剝奪模型:實驗室溫度控制在25℃左右，每天日光燈照射12 h后黑暗12 h;將大鼠放于水槽1的小平臺上，當其進入異相睡眠時期時由于全身肌肉張力降低導(dǎo)致面部觸水而驚醒，從而造成睡眠剝奪，共持續(xù)4 d。對照組放于水槽2的大平臺，可自由運動、睡眠;其他條件與SD組相同。

1.2.2 效果評估 制作長、寬、高分別為100 cm×100 cm×50 cm的木箱，其內(nèi)壁涂黑，箱底劃分成4 cm×4 cm的25個方格。采用礦場試驗評價睡眠剝奪效果:將兩組大鼠放入木箱中，計算其5 min內(nèi)水平活動和垂直活動得分。水平活動得分:大鼠斜跨1格或沿直線走兩格記為1分。垂直活動得分指直立次數(shù)，以動物雙足離開地面直至放下為1分。根據(jù)大鼠的一般狀況及水平活動、垂直活動得分判斷模型制作情況。結(jié)果顯示，對照組大鼠均性情溫和、毛色順滑、正?；顒?。SD組大鼠有尖叫、狂躁不安、打架、豎毛等睡眠剝奪應(yīng)激表現(xiàn)。SD組及對照組水平活動得分分別為(175.53 ±35.43)、(106.19 ±30.32)分，垂直活動得分分別為(32.43 ±5.13)、(12.45 ±5.38)分，P 均 ＜0.05。表明 SD 組睡眠剝奪模型成功建立。

1.2.3 觀察項目

1.2.3.1 TMJ病理變化 對照組、SD組分別于造模4 d后取材。1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后頸椎脫臼法處死，采用銳性分離與鈍性分離相結(jié)合，仔細分離顳下頜關(guān)節(jié)，上端從顳下頜關(guān)節(jié)上腔緊貼關(guān)節(jié)盤剪斷，下端從髁突頸部剪斷，完整取出顳下頜關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)盤、髁狀突。生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛液固定24 h。于1 mmol/L甲酸鈉和8 mmol/L甲酸等量混合的脫鈣液中脫鈣1周，流水沖24 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋。4 μm厚石蠟切片，行HE染色。顯微鏡下(100×)觀察關(guān)節(jié)髁突病理變化。

1.2.3.2 p38、MKK6蛋白表達 采用 SP免疫組織化學(xué)染色，取TMJ石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加封閉用正常山羊血清工作液;分別滴加 P-p38、P-MKK6一抗 50 μL，4 ℃濕盒過夜;陰性對照采用PBS代替一抗;加入山羊抗兔二抗，室溫孵育15 min;辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min;DAB顯色;蘇木精復(fù)染，脫水，透明;封片，顯微鏡(400×)下觀察。MKK6陽性蛋白主要表達于細胞質(zhì)，p38陽性蛋白主要表達于細胞核，少量在胞質(zhì)。以背景清晰、細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為MKK6陽性表達，細胞核中出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為p38陽性表達。每張切片取5個視野，分別計數(shù)細胞總數(shù)及其陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞率，取其平均值。陽性細胞率 ＜10%為 －;10% ～50%為+;＞50%為++;10% ～100%為陽性［6］。每個標本取連續(xù)5張免疫組化片，對顳下頜關(guān)節(jié)髁突的同一位置，采用數(shù)碼顯微照相系統(tǒng)拍照，Imagepro-Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件計數(shù)MKK6、p38的平均光密度值(MOD值)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件，計量資料以±s表示，采用方差分析、t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMJ病理變化 對照組TMJ髁突表面光滑，自表層向深層可分為四個帶:關(guān)節(jié)表面帶、增殖帶、纖維軟骨帶、鈣化軟骨帶。細胞排列規(guī)則，膠原纖維致密而規(guī)則。髁突、關(guān)節(jié)盤組織形態(tài)較好，關(guān)節(jié)腔隙正常。SD組大鼠TMJ關(guān)節(jié)髁突表面膠原纖維水腫、松解，排列紊亂，髁突組織學(xué)纖維軟骨結(jié)構(gòu)變薄，關(guān)節(jié)骨質(zhì)內(nèi)部分可見到骨細胞消失、骨陷窩空虛。見圖1。

圖1 兩組TMJ病理表現(xiàn)(×100，HE染色)

2.2 MKK8、p38蛋白表達 SD組、對照組 MKK6陽性細胞率分別為48.3%、0.2%;SD組p38陽性細胞率分別為49.2%、0.2%，P 均 ＜0.05。SD 組、對照組MKK6蛋白表達(MOD值)分別為0.254±0.008、0.108 ±0.061;p38 蛋白表達分別為 0.273 ±0.031、0.119 ± 0.071 ，均高于對照組(P 均 ＜0.05)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，睡眠障礙與TMD的發(fā)病存在一定聯(lián)系［7］。睡眠剝奪可以引起生物內(nèi)平衡失調(diào)以及生物節(jié)律紊亂，長期的睡眠剝奪還會降低免疫功能，使機體處于慢性應(yīng)激狀態(tài)［8］。本研究成功建立了大鼠睡眠剝奪模型，通過對TMJ的病理觀察，發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪大鼠TMJ髁突表面軟骨結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理性損傷，這種病理性損傷的出現(xiàn)已被證實與TMJ關(guān)節(jié)破壞的發(fā)生密切相關(guān)［9］。

p38通路激活后廣泛參與細胞凋亡、炎性因子的產(chǎn)生、細胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等［10］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，SD組TMJ關(guān)節(jié)軟骨中p38通路的上游激酶MKK6及p38的表達明顯增加，證實p38信號傳導(dǎo)通路被激活。其分子機制可能是睡眠剝奪狀態(tài)下大鼠咀嚼行為明顯增多和咬肌活動增加;TMJ因承受更多的運動負荷出現(xiàn)TMJ滑膜炎以及導(dǎo)致 IL-1、TNF-α 等炎性因子活性升高［9，11］。而這些炎性因子已被證實可激活p38信號通路［12］。p38信號通路激活后可在TMJ軟骨中促進基質(zhì)金屬蛋白酶的合成及基質(zhì)破壞，引起關(guān)節(jié)軟骨的病理性改變，對 TMJ髁突軟骨產(chǎn)生破壞，繼而引發(fā) TMD［13］。

綜上所述，睡眠剝奪可激活下頜髁突表面軟骨內(nèi)的p38信號通路，這一通路的激活與睡眠剝奪導(dǎo)致的髁突軟骨組織破壞密切相關(guān)。

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