橙皮苷對撲熱息痛和四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護作用

黃雋敏，雷 焦，舒克鋼，陳秀娟，聶 浩，龔 權

(長江大學醫學院，湖北荊州434023)

橙皮苷(HDN)是橙皮素與蕓香糖形成的糖苷，為二氫黃酮衍生物。既往研究顯示HDN具有多種藥理活性，如抗炎、抗脂質氧化、清除氧自由基［1，2］、抗腫瘤［3］、維持血管正常滲透壓、降血脂及保護心血管系統［4，5］等作用。Garg 等［6］研究發現 HDN 有較強的抑制和改善急性炎癥反應的抗炎活性作用。秦得安等［7］研究發現HDN對羥自由基有明顯的清除作用。Al-Ashaal等［8］研究發現橙皮苷對喉癌、宮頸癌、乳房癌和肝癌有顯著的抗腫瘤活性。近年來隨著對HDN藥效學研究的深入，HDN已成為藥物學研究的熱點。2012年3月～2013年2月，我們觀察了HDN對撲熱息痛(APAP)和四氯化碳(CCl4)導致的小鼠急性肝損傷的保護作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:清潔級昆明小鼠，雄性，體質量18～22 g，購自武漢大學動物實驗中心，質量合格證SCXK(鄂)2008-0004，分籠飼養，自由進食、飲水，自然晝夜節律光照。藥品和試劑:HDN、APAP購自美國Sigma公司;CCl4購自北京化學試劑公司;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自天津市科密歐化學試劑開發中心;甲醛購自武漢市中天化工有限責任公司;橄欖油為市售食用油。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性肝損傷模型制作［9，10］將50只小鼠隨機分為正常組、APAP組、CCl4組、HDN+APAP組、HDN+CCl4組，每組各10只。HDN+APAP組和HDN+CCl4組用 HDN 懸濁液(0.1 mL/10 g，溶于0.5%CMC-Na中)500 mg/kg灌胃，其他各組分別用同體積的0.5%CMC-Na溶液灌胃，均1次/d，連續10 d。末次給藥2 h后禁食不禁水，APAP組和HDN+APAP組腹腔注射APAP溶液175 mg/kg，CCl4組和 HDN+CCl4組腹腔注射0.4%CCl40.1 mL/10 g誘導急性肝損傷;正常組腹腔注射同體積0.5%CMC-Na溶液。

1.2.2 觀察項目

1.2.2.1 血清ALT、AST、LDH 水平 制模16 h后，小鼠眼球取血0.5 ～1.0 mL，室溫靜置30 min，4 ℃3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用自動生化分析儀檢測ALT、AST、LDH水平。

1.2.2.2 肝指數 眼球取血后處死各組小鼠，迅速解剖肝臟，冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干稱重，計算肝指數。肝指數=肝質量(g)/體質量(g)×100%。

1.2.2.3 肝臟病理改變 取肝右葉，用10%中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下(HE染色，400×)觀察肝臟病理組織學改變。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0軟件行統計學處理，數據以±s表示，多組間比較采用F檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肝指數及血清ALT、AST、LDH水平比較見表1。

表1 各組肝指數及血清ALT、AST、LDH水平比較(±s)

表1 各組肝指數及血清ALT、AST、LDH水平比較(±s)

注:與正常組比較，△P ＜0.01;與 APAP組比較，*P ＜0.01，#P ＜0.05;與CCl4組比較，▲P ＜0.05，★P ＜0.01

組別 肝指數(%) ALT(U/L) AST(U/L) LDH(U/g)APAP 組 4.42 ±0.27△ 1 398.47 ±291.37△ 2 864.02 ±829.50△7 394.35 ± 953.49 HDN+APAP 組 3.91 ±0.19# 259.38 ± 74.87* 589.40 ±153.88* 4 064.49 ±1 008.00 CCl4組 4.40 ±0.13△ 1 392.11 ±265.66△ 3 007.19 ±989.09△ 7 876.54 ±1 437.43△HDN+CCl4組 4.09 ±0.15▲ 391.31 ±100.42★ 643.19 ±156.20▲ 4 420.32 ±1 100.85▲正常組 3.88 ±0.43 52.56 ± 10.74 154.49 ± 26.30 1 170.00± 283.97

2.2 各組肝組織病理學變化 大體觀察發現，正常組肝臟顏色紅潤，被膜光滑，有光澤，邊緣銳利，質軟而富有彈性。APAP組肝臟外觀腫大，顏色略黃，出現灰黃色點狀壞死灶，分布尚均勻，無光澤，質地較脆。CCl4組肝臟外觀體積腫大，邊緣鈍而厚，色澤灰黃無光伴有黃褐色斑塊，均勻分布，個別肝臟可見明顯片狀淤血。HDN+APAP組及HDN+CCl4組肝臟顏色稍紅潤，形態接近正常。光鏡下可見，正常組肝小葉結構清晰完整，肝索排列整齊，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，大小均勻，無變性、壞死，無炎癥細胞浸潤等病理改變(見圖1A)。APAP組肝細胞形態被破壞，可見明顯圍繞中央靜脈的大片狀壞死，肝細胞有不同程度的變性、壞死并伴大量炎性細胞浸潤(見圖1B)。與APAP組比較，HDN+APAP組肝細胞索形態接近正常，肝細胞壞死程度明顯減輕，炎癥細胞浸潤顯著減少(見圖1D)。CCl4組肝組織肝小葉結構排列紊亂，肝細胞明顯腫脹、壞死，伴明顯組織充血和大量炎性細胞浸潤(見圖1C);與CCl4組比較，HDN+CCl4組肝腫脹程度明顯減輕，肝小葉結構清楚，肝細胞排列較整齊，壞死明顯減少，可見少量炎性細胞浸潤，肝組織炎癥明顯改善(見圖1E)。

圖1 各組肝臟病理學變化光鏡圖(HE×400)

3 討論

橙皮苷來源廣泛，價格低，易獲取，主要存在于天然植物陳皮、枳實、柑橘皮中，尤其在中藥陳皮中含量豐富［11］。橙皮苷具有多種藥理、營養等價值活性，特別在醫藥領域其研究已涉及到心血管、內分泌、抗癌、抗突變、免疫、抗菌消炎、抗衰老等諸多方面。近年來橙皮苷在醫藥、食品、運動營養學等領域的研究日益深入，橙皮苷的化學成分及藥理藥效作用的進一步明確，使得其開發利用具有重大的經濟和社會效益。

APAP是臨床常用的解熱鎮痛藥，過量使用或體內蓄積時可以造成嚴重的肝損害［12］，其誘導小鼠急性肝損傷動物模型是臨床上篩選保肝藥物的常用模型之一。目前認為APAP在體內主要經肝細胞色素P450代謝，生成毒性中間代謝產物N-乙酸—對苯醌亞胺(NAPQI)，其絕大部分與硫酸及葡葡糖醛酸結合，經腎臟排出體外。當APAP攝入量超過機體代謝限度時，NAPQI未能及時處理，就與肝細胞膜結合，引起細胞膜脂質過氧化反應，導致細胞壞死和死亡，造成肝損傷［13］。CCl4誘導急性肝損傷動物模型也是一種經典的篩選和研究肝炎治療藥物的病理模型［14］，具有操作簡便、適用性廣和重復性好等優點。目前學者認為CCl4進入體內后，通過肝細胞色素P450而產生肝毒性代謝產物，生成活潑的三氯甲基自由基(·CCl3)和氯自由基(·Cl)，這些自由基可使細胞膜脂質過氧化，使膜結構和功能破壞，并抑制細胞膜和微粒體膜上鈣泵活性導致鈣內流增加，從而導致肝細胞凋亡和壞死，內源性轉氨酶釋放到胞外［15］。APAP和CCl4引起的急性肝損傷均有通過肝細胞色素P450代謝而產生肝毒性產物導致肝細胞膜破壞造成肝細胞的損壞。但APAP引起藥物性肝損傷，而CCl4則導致化學性肝損傷，兩者損傷途徑及機制有一定的不同。所以探討橙皮苷對兩種不同損傷機制引起的肝損傷是否具有保護作用，具有一定的實驗意義。ALT和AST存在于正常肝細胞內，肝細胞受損時外排入血液，ALT活性主要反應肝細胞損傷，AST可反映線粒體的受損程度［16］;LDH是一種糖酵解酶，它廣泛存在于肝臟、心臟等多種組織器官當中。當組織器官出現病理變化時，LDH就會釋放到血液中，是組織損傷的較敏感指標之一，臨床上常用其活性來評定肝功能受損程度［17］。這三者是常用的判斷肝臟損傷程度的重要指標。

本研究中，APAP模型組和CCl4模型組小鼠肝指數、血清ALT、AST、LDH的含量均明顯升高，與正常組相比，差異均具有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)，肝臟病理學切片肝細胞大片壞死，表明本研究成功建立APAP和CCl4所致急性肝損傷動物模型。與APAP模型組和CCl4模型組相比，APAP+HDN組和CCl4+HDN組小鼠肝指數、血清的ALT、AST、LDH含量各有所降低(P＜0.01或P＜0.05)，病理組織學顯示肝損傷壞死和炎細胞浸潤程度均明顯減輕，表明HDN對APAP和CCl4引起的急性肝損傷均具有保護作用。

綜上所述，HDN對APAP和CCl4誘導小鼠急性肝損害均有一定的保護作用。因APAP、CCl4造成小鼠急性肝損害的機制不同，HDN可能通過作用于肝細胞不同的代謝環節而發揮對肝臟的保護作用，其具體機制還有待進一步研究。

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