九香蟲的石油醚及甲醇粗提物對SGC7901細胞增殖和細胞周期的影響

劉川燕，張 莉，侯曉暉，昌 藝，孫志誠

(遵義醫(yī)學院，貴州遵義563099)

九香蟲屬半翅目蝽科，是重要的藥用昆蟲。現(xiàn)代醫(yī)學證實，九香蟲具有抗炎、抗菌、抗癌、促纖溶、解痙、鎮(zhèn)痛及恢復機體免疫功能等多種作用［1］。我們前期研究［2，3］用氯仿和乙醇粗提九香蟲有效成分進行腫瘤細胞的體外實驗，發(fā)現(xiàn)九香蟲粗提物雖能抑制腫瘤細胞體外增殖，但并非通過影響細胞周期而產(chǎn)生作用。在上述基礎上，2011年11月～2012年4月，我們以石油醚和甲醇為試劑，提取九香蟲體內(nèi)的有效成分，對其抗癌作用機制進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌細胞株SGC7901，由遵義醫(yī)學院中心實驗室惠贈;九香蟲樣品購自遵義百頤醫(yī)藥有限責任公司，研成粉末備用;胎牛血清;PBS;胰蛋白酶;青霉素;鏈霉素;RPMI Medium DMEM培養(yǎng)基;MTT粉末;DMSO;C1052細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 九香蟲粗提物的制備 取九香蟲粉末11 g，分別以石油醚和甲醇為溶劑、索氏提取器連續(xù)回流提取法提取九香蟲有效成分，分別收集提取液(九香蟲粗提物)，待自然揮干，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng)與傳代 將胃癌細胞SGC7901置5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)中，10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞呈單層生長并鋪滿平底時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3 細胞分組及干預 取已傳代的細胞，設石油醚組、甲醇組、陰性對照組和空白對照組，每組6個復孔。石油醚組分別加入濃度為35、52、79、118、178、267、400 μg/mL 的石油醚粗提物，甲醇組分別加入濃度為 70、105、158、237、355、533、800 μg/mL的甲醇粗提物，均按1.5倍稀釋;陰性對照組加入含有石油醚或甲醇的培養(yǎng)基;空白對照組中僅加入培養(yǎng)基。

1.2.4 檢測項目

1.2.4.1 SGC7901細胞形態(tài)變化 給藥48 h后，倒置顯微鏡下觀察各組SGC7901細胞形態(tài)的變化。

1.2.4.2 SGC7901細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板中［4］。給藥48 h后采用MTT法，檢測490 nm波長下的吸光度(A)值，重復3次取均值。計算細胞增殖抑制率［增殖抑制率=(1－給藥孔A值/對照孔A值)×100%］及IC50［4，5］。

1.2.4.3 SGC7901細胞周期變化 石油醚中劑量組及高劑量組分別采用濃度為1/2 IC50及IC50的石油醚粗提物干預;甲醇中劑量組及高劑量組分別采用1/2 IC50、IC50濃度的甲醇粗提物干預。空白對照組不干預。培養(yǎng)48 h后收集細胞，PBS洗滌、70%乙醇固定;避光條件下加入染色液200 μL，吹打均勻;避光預熱30 min后，4℃放置備用。流式細胞儀檢測細胞周期，結(jié)果用CELL Quest軟件分析，統(tǒng)計各組S期、G2～M期、G0～G1期的細胞比例。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SGC7901細胞形態(tài)變化 空白對照組細胞呈梭形，細胞貼壁、透明度較大、胞膜清晰，生長旺盛。陰性對照組細胞未發(fā)生改變。石油醚組及甲醇組則表現(xiàn)為細胞變圓、皺縮，細胞間空隙加大，染色質(zhì)固縮、胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀異物，形成較多的細胞碎片。見圖1。

圖1 九香蟲的石油醚及甲醇粗提物對SGC7901細胞形態(tài)的影響(200×)

2.2 SGC7901細胞增殖抑制率 石油醚組和甲醇組細胞增殖抑制率均低于空白對照組(P均＜0.05)，且呈劑量依賴性，見表1。石油醚和甲醇的IC50分別為 52.3 μg/mL 及 168.8 μg/mL。

2.3 SGC7901細胞周期變化 與空白對照組相比，石油醚組和甲醇粗提物干預后S期及G2～M細胞比例增加，G0～G1期細胞比例降低(P＜0.05)，甲醇組的效果優(yōu)于石油醚組。見表2。

表1 不同濃度石油醚和甲醇粗提物對SGC7901細胞增殖抑制率的影響(±s)

表1 不同濃度石油醚和甲醇粗提物對SGC7901細胞增殖抑制率的影響(±s)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05

組別 細胞增殖抑制率(%)石油醚組35 μg/mL 11.22 ±0.14*52 μg/mL 53.79 ±0.09*79 μg/mL 86.35 ±0.01*118 μg/mL 88.03 ±0.01*178 μg/mL 89.35 ±0.01*267 μg/mL 90.92 ±0.01*400 μg/mL 91.05 ±0.00*甲醇組70 μg/mL 16.84 ±0.05*105 μg/mL 23.85 ±0.07*158 μg/mL 42.71 ±0.05*237 μg/mL 80.56 ±0.06*355 μg/mL 83.51 ±0.02*533 μg/mL 86.10 ±0.00*800 μg/mL 87.40 ±0.01*

表2 各組SGC7901細胞周期變化(%，±s)

表2 各組SGC7901細胞周期變化(%，±s)

注:與空白對照組相比，*P＜0.05

*石油醚高劑量組 58.85 ±8.01 34.63 ±5.12* 6.51 ±2.89石油醚中劑量組 55.28 ±4.02 34.61 ±3.68* 10.12 ±1.94甲醇高劑量組 42.12 ±0.28*40.59 ±0.99* 17.29 ±0.74*甲醇中劑量組 57.67 ±1.81*33.88 ±0.77* 8.46 ±1.05*空白對照組61.45 ±5.40 29.37 ±1.76 9.19 ±3.91

3 討論

九香蟲粗提物的成分具有抗腫瘤作用［6～9］。以往多采用浸提法提取九香蟲的有效成分。本研究中采用連續(xù)回流提取法，其優(yōu)點為操作簡便、節(jié)省試劑，缺點是時間耗時較長、對受熱易分解的成分不宜采用［10］。理論上，溫度過高會導致九香蟲體內(nèi)的物質(zhì)被破壞，從而對實驗結(jié)果造成影響。

本研究中兩種方式獲得的九香蟲粗提物對SGC7901細胞體外增殖均有明顯的抑制作用，提示采用該方法進行抗癌有效成分提取是可行的，但是否有其他抗癌有效成分被破壞還有待進一步深入研究。

石油醚和甲醇均為天然產(chǎn)物提取的常用試劑，與我們前期研究中采用的氯仿和乙醇相比，兩者分別具有親脂性強和穿透力強的優(yōu)點［10］。九香蟲氯仿和乙醇粗提物對SGC7901細胞體外增殖的的IC50分別為 1 281.62 μg/mL 和 1 193.52 μg/mL［2，3］。本研究發(fā)現(xiàn)，石油醚和甲醇粗提物的 IC50為52.3 μg/mL 和168.8 μg/mL，有效濃度大大降低，抑制作用提高，說明兩者作為試劑進行抗癌有效成分提取是高效的。本研究結(jié)果顯示，九香蟲的石油醚和甲醇粗提物均可抑制SGC7901細胞的體外增殖，但前者顯著優(yōu)于后者，提示石油醚提取的粗提物中抗癌有效成分量和(或)作用高于甲醇。另外，細胞周期檢測結(jié)果證實，兩種粗提物對細胞增殖的抑制是由于其細胞周期的阻滯作用，使得SGC7901細胞停滯于S

期，S期作為DNA合成、染色質(zhì)組裝和中心粒復制的主要時期［11～13］，其明顯改變會影響細胞增殖。與我們前期研究［2，3］(氯仿和乙醇)結(jié)果相比，石油醚和甲醇粗提物對SGC7901細胞增殖及細胞周期的影響更顯著。

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