宮頸脫落細(xì)胞HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA在宮頸病變篩查中的應(yīng)用

周 星，劉麗華，張金庫(kù)，趙文明，姜 麗，陳 紅，周炳娟

(1河北聯(lián)合大學(xué)，河北唐山063000;2保定市第一中心醫(yī)院)

子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)是宮頸癌的癌前病變。研究發(fā)現(xiàn)［1.2］，高危型乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染、病毒癌基因HPV E6/E7 mRNA表達(dá)與宮頸癌發(fā)病有關(guān)，二者在CIN中陽(yáng)性率較高。對(duì)HR-HPV進(jìn)行檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)宮頸癌早期病變或具有高危因素的人群，已被列為宮頸癌篩檢項(xiàng)目之一。2011年8月～2013年9月，我們收治宮頸病變患者301例，現(xiàn)分析其HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA檢測(cè)結(jié)果，探討其在宮頸病變篩查中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集保定市第一中心醫(yī)院2011年8月～2013年9月門(mén)診及病房收治的宮頸病變患者301例，年齡20～65歲，中位年齡39歲。其中慢性宮頸炎95例;癌前病變190例，其中CIN1 72例，CIN2 58例，CIN3 60例;宮頸鱗狀細(xì)胞癌16例。將CIN2以上病變定為癌前病變［3］。

1.2 宮頸脫落細(xì)胞HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA表達(dá)檢測(cè) 用窺器暴露宮頸后，宮頸細(xì)胞專(zhuān)用采樣刷插入子宮頸口旋轉(zhuǎn)5周，收集宮頸口鱗柱交界區(qū)的脫落上皮細(xì)胞，并將刷頭部放入裝有專(zhuān)用保存液的瓶?jī)?nèi)并編號(hào)。取1/2樣本采用HC2法檢測(cè)HR-HPV DNA，重復(fù)檢測(cè)每份樣本兩次并取均值，HPV陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為RLU/CO＞1.0。剩余1/2樣本采用bDNA技術(shù)檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA。將樣本倒入15 mL離心管，3 000 r/min離心5 min后倒掉上清液;加入2 mL DDH2O，反復(fù)吹打或振蕩器振蕩，使細(xì)胞全部混懸，加入300 μL組織裂解液和3 μL蛋白酶K，65℃孵育30 min，加入終止反應(yīng)液終止反應(yīng);制成的細(xì)胞懸浮液用宮頸穩(wěn)態(tài)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)試，將反應(yīng)板放入冷光儀，經(jīng)計(jì)算軟件自動(dòng)讀取HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)值;重復(fù)檢測(cè)每份樣本兩次并取均值，以平均拷貝數(shù)值(Copies/cell)＞1.0為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA 診斷癌前病變的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 以病理結(jié)果為參照，比較HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA的靈敏性、特異性及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。

1.3.2 不同年齡者HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA的陽(yáng)性率 將患者按照年齡分為＜30歲、30～39歲、40～49歲及＞50歲，比較各年齡段患者中兩項(xiàng)指標(biāo)的陽(yáng)性率。

1.3.3 不同病變程度者HPV E6/E7 mRNA與HRHPV DNA的陽(yáng)性率 將患者按照病變程度分為CIN1、CIN2、CIN3和宮頸癌四個(gè)水平，比較各病變中兩項(xiàng)指標(biāo)的陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA 診斷癌前病變的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 HPV E6/E7 mRNA的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為50.8%(68/134)、85.6%(143/167)、80.2%(97/121)，HRHPV DNA的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為79.1%(106/134)、62.9%(105/167)、63.1%(106/168)，HPV E6/E7 mRNA的診斷靈敏性低于HRHPV DNA(P＜0.05)，特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高于HPV DNA(P 均 ＜0.05)。

2.2 不同年齡受檢者HPV E6/E7 mRNA與HRHPV DNA的陽(yáng)性率比較 在30歲以下與30～39歲的受檢者中HPV E6/E7 mRNA的陽(yáng)性率低于HR-HPV DNA(P均＜0.05);在40～49歲及50歲以上的受檢者中二者陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。30歲以下的受檢者HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率最低，HR-HPV DNA的陽(yáng)性率最高;隨著年齡增加，HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率有逐漸升高趨勢(shì)，HR-HPV DNA的陽(yáng)性率逐漸降低。見(jiàn)表1。

表1 不同年齡者HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA的陽(yáng)性率比較(%)

2.3 不同病變程度受檢者HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA的陽(yáng)性率比較 CIN2、CIN3和宮頸癌者HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率高于慢性宮頸炎者，且CIN3者高于CIN2者(P均＜0.05);CIN1、CIN2、CIN3及宮頸癌患者HR-HPV DNA的陽(yáng)性率高于慢性宮頸炎患者(P均＜0.05)，CIN2與CIN3者中陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。

表2 不同病變程度者HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA的陽(yáng)性率比較(%)

3 討論

HR-HPV 是宮頸癌感染的主要誘因［4，5］，但只有少數(shù)感染會(huì)發(fā)展成惡性疾病，原因是惡性腫瘤的發(fā)展需要E6和E7癌基因在整合的HPV基因組中表達(dá)［6，7］。兩個(gè)病毒癌基因通過(guò)鈍化腫瘤抑制蛋白p53和pRb［8］促進(jìn)不規(guī)則細(xì)胞的生長(zhǎng)，導(dǎo)致宿主細(xì)胞癌變，若沒(méi)有表達(dá)E6和E7基因，細(xì)胞自身不會(huì)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［9］，而此時(shí)宿主可能已感染了 HRHPV，其DNA檢測(cè)顯示為陽(yáng)性。本研究發(fā)現(xiàn)，與HR-HPV DNA相比，HPV E6/E7 mRNA表達(dá)對(duì)CIN2［10，11］有更高的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，但靈敏性較低，提示HPV E6/E7 mRNA比HR-HPV DNA準(zhǔn)確度更好［12］。在臨床應(yīng)用中，CIN1患者可行HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)癌變風(fēng)險(xiǎn)，陽(yáng)性者可積極采取治療措施;對(duì)于宮頸癌術(shù)后患者，可檢測(cè)陰道殘端HPV E6/E7 mRNA預(yù)估風(fēng)險(xiǎn)，選擇隨訪間隔時(shí)間，預(yù)防復(fù)發(fā)。由于HPV還與直腸癌、食道癌、陰道癌等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性要考慮導(dǎo)致陰道斷端復(fù)發(fā)的可能［13］，應(yīng)做好這方面的隨訪。本研究結(jié)果顯示，40歲以下者HR-HPV DNA的感染率高達(dá)50%，但HPV E6/E7 mRNA的檢出率較低，說(shuō)明此年齡段大部分HPV感染可以消退，只有少部分有惡性進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn);對(duì)于40歲以上婦女的HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)相對(duì)更有意義。隨著年齡增加，HR-HPV DNA的陽(yáng)性率有降低趨勢(shì)，HPV E6/E7 mRNA的陽(yáng)性率逐漸升高，40歲以上者中二者陽(yáng)性率相近且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明年齡較大者感染HPV后進(jìn)展為惡性病變的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較大，應(yīng)盡早采取措施。HPV E6/E7 mRNA的陽(yáng)性率在CIN1和CIN2者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而HR-HPV DNA無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明對(duì)診斷為不典型鱗狀上皮(ASC-US)或低度上皮內(nèi)病變(LISL)的患者，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)能更加準(zhǔn)確地提示病毒感染進(jìn)展情況。根據(jù)病毒基因是否整合入宿主基因組中，可判斷HPV E6/E7基因產(chǎn)物的表達(dá)狀態(tài)，以提高宮頸疾病的篩查效率。

綜上所述，HPV E6/E7mRNA檢測(cè)相對(duì)HRHPV DNA檢測(cè)特異性及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較高，有望成為宮頸疾病篩查更好的指標(biāo)，對(duì)宮頸癌的預(yù)防、治療及降低宮頸癌發(fā)病率和病死率具有積極意義。

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